亲属肾移植患者术后肾功能与HLA配型和PRA相关性研究

贾保祥 马威然 田 野

(首都医科大学附属北京友谊医院泌尿科，北京 100050)

人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)配型是器官移植患者术前选择最佳移植供者的重要检测之一，而肾移植术后群体反应性抗体(panel reactive antibody，PRA)检测则是鉴别移植物发生排斥反应的重要监测项目之一。血肌酐也是判断肾移植术后移植肾功能的重要指标之一。目前，在移植肾源极其匮乏的情况下，了解亲属肾移植供受者HLA配型的配合率的多寡和PRA抗体在亲属肾移植术后产生的概率，对预测移植肾的长期存活具有一定的临床意义。因此本文对亲属肾移植受者肾移植术后1～4的HLA配型、PRA产生概率和肾功能变化进行了追踪研究，报告如下。

1 研究对象和方法

1.1 研究对象

研究对象为2006年4月至2009年12月于首都医科大学附属北京友谊医院进行亲属肾移植的336例患者，其中男性245例，女性91例，最大年龄58岁，最小年龄10岁。将患者分为5组:第1组为接受父母移植肾的患者118例，其中男性96例，女性22例。第2组为接受子女移植肾的患者12例，其中男性5例，女性7例。第3组为接受兄弟姐妹移植肾的患者107例，其中男性76例，女性31例。第4组为接受其他亲属移植肾的患者92例，其中男性64例，女性28例。第5组为夫妻间肾移植的患者7例，其中男性4例，女性3例。

亲属肾移植供者年龄最大67岁，最小21岁。其中第1组的供者中男性患者51例，女性67例。第2组的供者中男性10例，女性2例。第3组的供者中男性71例，女性36例。第4组供者中男性77例，女性15例。第5组供者中男性3例，女性4例。

1.2 试验方法

1.2.1 HLA 分型

采用美国莱姆德公司和美国GTI公司提供的低分辨SSP-HLA-Ⅰ类、Ⅱ类分型试剂。操作步骤如下:1)提取DNA:① 取 EDTA抗凝血2 mL，3 000 r/min离心5 min。②吸取白细胞层，加入红细胞裂解液8～10 mL，混匀。③3 200 r/min离心8 min。④ 弃上清，加入白细胞裂解液 2 mL、10%SDS 60 μL、5 mol/L 的高氯酸钠500 μL、饱和氯化钠 1 mL，充分混匀。⑤ 2 600 r/min离心15 min。⑥小心吸取上清加入到4 mL异丙醇中，待 DNA析出，用70%乙醇洗2～3次。⑦ 待DNA干燥后加入400～600μL蒸馏水，溶解DNA备用。2)扩增:① 每人份取D-Mix 1管，加入Taq酶7μL(5 U/μL)、DNA 111 μL，充分混匀。② 点入96 孔板，每孔10μL。③置入PCR仪扩增，扩增条件:96℃ 130 s，63℃ 60 s，1 个循环，96 ℃ 10 s，63 ℃ 60 s，9 个循环，96 ℃10 s，59 ℃ 50 s，72 ℃ 30 s，20 个循环，4 ℃结束。3)电泳:①用TBE缓冲液配制2.5%琼脂糖凝胶。②将扩增产物移至凝胶中进行电泳，150 V 3～4 min。③紫外灯下观察结果。

1.2.2 PRA 检测

采用美国莱姆德公司抗原筛选板和美国GTI公司提供的ELISA筛选HLA-Ⅰ类、Ⅱ类混合抗原板。鉴定抗体类型采用采用美国莱姆德公司鉴定抗原板(LAT-1240)，其抗原板包含21种HLA-A抗原特异性，29种HLA-B抗原特异性，15种HLA-Cw抗原特异性，14种HLA-DR抗原特异性，7种HLA-DQ抗原特异性。操作步骤按说明书。

1.2.3 血肌酐/尿素氮检测

血肌酐/尿素氮检测数据由检验科提供，由于肾移植患者术后导致肾功能下降的因素较多，故把血肌酐正常值115 μmol/L，尿素氮正常值7.14 mmol/L 提至血肌酐正常值130 μmol/L，尿素氮正常值8 mmol/L，以此调整肾移植术后患者调理不当引起的肾功能不正常。凡患者肾移植术后血肌酐、尿素氮值分别高于130 μmol/L和8 mmol/L，均认为移植肾功能下降。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件进行分析。计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肾移植患者术后肾功能变化及 PRA的产生

1)父母给子女供肾组:118例接受父母移植肾的患者中，有36例患者肾功能下降，占30.51%(36/118);8例为 PRA 阳性，占6.78%(8/118)，其中3例为 HLA-Ⅰ+Ⅱ抗体阳性，5例为HLA-Ⅱ抗体阳性，详见表1。

2)子女给父母供肾组:12例接受子女移植肾的患者中仅1例肾功能下降，且为再次肾移植患者。12例患者PRA均阴性，详见表1。

3)兄弟姐妹间供肾组:107例接受兄弟姐妹移植肾的患者中13例患者肾功能下降，占12.15%(13/107);3例PRA阳性，占2.80%(3/107)，其中1例Ⅰ+Ⅱ类抗体阳性，2例HLA-Ⅱ类抗体阳性。由此可见，接受兄弟姐妹移植肾的患者PRA产生的概率较低，而且功能下降者也少，详见表1。

4)其他亲属供肾组:92例接受其他亲属移植肾的患者中有11例患者肾功能下降，占11.96%(11/96);6例患者PRA阳性，占6.52%(6/92)，其中2例为HLA-Ⅰ+Ⅱ类抗体阳性，4例为HLA-Ⅱ类抗体阳性，详见表1。

5)夫妻间供肾组:7例接受夫妻间移植肾的患者HLA配型中均未有HLA-B抗原配合，其中有2例患者肾功能下降，且为PRA阳性，占28.57%(2/7);1例为HLA-Ⅰ类抗体阳性，1例为HLA-Ⅱ类抗体阳性，详见表1。

表1 亲属肾移植患者HLA配型与肾功能的变化及PRA的产生Tab.1 HLA-typing and panel reactive antibody(PRA)with posttransplant renal function in related living donor renal transplantation

2.2 各组肾移植患者HLA配型及直系亲属与其他亲属抗原半相合比较

1)各组肾移植患者HLA配型:第1组的118例肾移植供受者HLA-A、B、DR、DQ抗原单体型半相合，其中有22例抗原配合率高于单体型半相合。第2组的12例肾移植供受者HLA-A、B、DR、DQ抗原单体型半相合，其中有7例HLA抗原配合率高于单体型半相合。第3组的107例兄弟姐妹间HLA-A、B、DR、DQ配型完全相配合有18例，73例为单体型半相合或大于单体型半相合，其余为低于单体型半相合或不相合。第4组的92例其他亲属移植的供受者间HLAA、B、DR、DQ等于或大于单体型半相合的有24例，完全不相合的有9例，虽然HLA抗原配合率大于4个抗原，但并不是单体型半相合抗原的有8例，等于或小于3个抗原配合的有51例。第5组的7例夫妻间移植患者，HLA配合率均≤3个抗原。

2)直系亲属与其他亲属抗原半相合比较:在直系亲属如接受父母、子女及兄弟姐妹供肾的237例患者中分别有118例、12例及91例患者的HLA-A、B、DR、DQ抗原单体完全相配合和半相合或大于半相合，占93.25%(221/237)。

92例接受其他活体移植肾的患者中HLA-A、B、DR、DQ等于或大于半相合的有24例，占26.07%(24/92)。直系亲属与其他亲属抗原半相合比较差异有统计学意义 (P＜0.000 1)。

3 讨论

目前，在尸体肾移植肾源极其匮乏的情况下，亲属肾移植是移植肾的首选肾源。亲属活体肾移植具有非活体肾移植不可替代的诸多优势，如可提高HLA配型和手术成功率，缩短患者等待肾源的时间，手术时机可选择，供肾质量提高等。因此，了解亲属肾移植供受者HLA配型配合率的多寡，对预测移植肾的长期存活具有一定的临床意义。HLA配型是器官移植术术前检测项目中最重要的检测之一，HLA配型在肾移植术中的应用对提高移植肾的长期存活率及对抗HLA抗体高敏感的患者的肾移植具有重要意义。良好的HLA配型是维持移植器官长期存活的必备因素之一。进行活体肾移植术能够在亲属中选择更加适宜的供体，降低了肾移植术后急性排斥的发生率，提高了人/肾存活率，还可降低免疫抑制剂用量，降低了药物毒性反应的发生，同时节省了患者的费用。

肾移植供受者HLA配合率高，可降低抗HLA抗体的生成。群体反应性抗体(PRA)的产生是导致肾移植术后发生排斥的重要因素之一，PRA的产生主要由术前输血、妇女妊娠和再次移植前的移植物刺激所致。PRA的存在与急慢性排斥反应，急性血管排斥反应的发生均有关系。PRA水平越高，意味着其预致敏程度越高，移植后发生排斥反应的概率越高;相应的此受者等待供受者之间淋巴毒交叉配型阴性的肾移植的概率也越少。Singh D等［1］分析了406例抗体高敏感的患者术前抗HLA抗体与术后排斥反应发生率的关系发现，术前PRA显著下降的患者移植肾存活率显著高于术前PRA保持峰值水平者。其中术前PRA＜26%且峰值PRA与术前PRA之差＞37%者预后最好。

由本研究结果可见，即使在亲属及兄弟姐妹间HLA抗原达到完全配合的也较少。良好的HLA配型不仅可明显减少排斥反应的发生而且可以提高移植肾的长期存活率。由于HLA基因的多态性，对于实体肾移植，获得良好的配型势必要增加患者术前等待时间，而存在血缘关系的亲属供肾可有效解决这一问题［2］。HLA错配在初次和再次的尸体肾移植可降低移植肾存活率，而在亲属肾移植中患者HLA错配的存活率则基本相同［3］。因此亲属间的器官移植可缩短移植受者等待移植器官的时间，而且可得到非亲属肾移植供受者间不易得到的HLA配合率。HLA配合率的降低，更容易在肾移植术后产生抗供者特异性抗体，从而导致抗体介导的急性排斥反应的发生。

Li X等［4］研究了87例活体肾移植患者，供者特异性抗体阳性的患者有80%出现了排异症状。术后出现抗体的患者，其5年肾存活率为69%，而术前术后抗体均为阴性的患者，5年肾存活率为96%，术前阳性术后阴性的患者，5年肾存活率88%，术前术后抗体均阳性的患者，5年肾存活率为93%。因此认为肾移植患者若在术后产生了新的抗体，尤其是供者特异性抗体(尽管术前PRA阴性)，其发生排异的概率较高。因此术后及时监测HLA抗体具有重要意义。袁小鹏等［5］对肾移植术后1～14 d发生抗体介导的急性排斥(AMR)反应的患者进行抗供者特异性抗体的检测，发现15例患者中术后出现抗供者特异性HLA-Ⅰ类抗体的有9例，抗HLA-Ⅱ类抗体的有4例，同时出现抗HLA-Ⅰ和Ⅱ类抗体的患者2例。经抗排斥治疗后14例患者逆转，1例患者术后10 d切除移植肾。15例患者的供受者HLA配型均有不同程度的HLA错配，故而产生抗供者特异性抗体，加大了急性排斥反应的发生率。可见良好的HLA配合的重要性在于，可避免产生抗供者特异性抗体，降低移植肾的急性排斥发生率。同时，对于再次移植的患者，HLA供受者间的配合率尤其显得更重要，因为在再移植的受者中，抗HLA抗体生成的概率比肾移植术前输血者高很多，二者间有非常大的差异［6］。同时HLA的错配可增加再次肾移植受者的致敏性，初次肾移植接受HLA-A，-B，-DR抗原零错配或 HLA-A，-B抗原零错配的患者PRA没有变化。然而，在初次肾移植HLA错配数越多，则PRA的增加越显著。HLA-A，-B抗原零错配的移植受者仅10%成为致敏者，而增加HLA错配则致敏率则可高达37%［7］。由此可见，亲属肾移植在HLA配型中具有特殊的优势，其HLA错配率可大大低于非亲属肾移植患者。

在本研究中可见，92例其他亲属肾移植的患者中，供受者间HLA-A、B、DR、DQ等于或大于单体型半相合的有24例;完全不相合的有9例;虽然HLA抗原配合率大于4个抗原，但并不是单体型半相合抗原的有8例;等于或小于3个抗原配合的有51例。经过直系亲属与其他亲属HLA-A、B、DR、DQ单体型半相合比较，两者间差异有统计学意义。由此可见，非直系亲属HLA的配合率低于直系亲属。而从另一方面证实HLA的配合率在人群中达到完全配合实属不易，这是由于HLA的多态性所致。在亲属活体肾移植者中，对其近期肾功能和PRA的检查中发现，移植肾功能下降和PRA阳性在亲属间发生的概率均较低，由本研究结果可见，接受父母移植肾患者可能由于供者年龄较高，导致移植肾功能下降，但PRA产生的概率则较低。而接受兄弟姐妹间移植肾的患者PRA产生的概率同样较低，且移植肾功能下降者也少。而在接受其他亲属移植肾的患者中，同样表现出基本相似的结果。由此可见，HLA配型在移植肾短期存活中并没有其必然优势，而供者的年龄则是影响移植肾功能的重要因素之一。而肾移植术后PRA生成的概率较低与肾移植供受者HLA的配型具有一定的关系。因此，选择HLA配型理想、PRA阴性的供受者是提高移植肾长期存活率的关键，可杜绝移植肾的超急性排斥反应，并减少急性排斥的发生率。

［1］Singh D，Kiberd B A，West K A.Importance of peak PRA in predicting the kidney transplant survival in highly sensitized patients［J］.Transpl Proc，2003，35(7):2395-2397.

［2］于立新，叶俊生，邓文峰，等.高度致敏受者肾移植的临床处理［J］.中华泌尿外科杂志，2008，29(3):185-187.

［3］Mizutani K.HLA mismatches and PRA in kidney retransplants［J］.Clin Transpl，2007:19-27.

［4］Li X，Ishida H，Yamaguchi Y，et al.Poor graft outcome in recipients with de novo donor-specific anti-HLA antibodies after living rlated kidney transplantation［J］.Tanspl Int，2008，21(12):1145-1182.

［5］袁小鹏，王长希，陈立中，等.肾移植术后急性体液性排斥反应的治疗［J］.中华器官移植杂志，2009，30(5):268-270.

［6］贾保祥，孙利宁，武俊杰，等.肾移植患者术前输血与再次移植致抗体生成的比较［J］.国际外科学杂志，2009，36(10):668-671.

［7］Meier-Kriesche H U，Scornik J C，Susskind B，et al.A lifetime versus a graft life approach redefines the importance of HLA matching in kidney transplant patients［J］.Transplantation，2009，88(1):23-29.