多发性硬化病人血清和脑脊液壳三糖苷酶活性的研究

王运良 张玉镇 耿同超 张晓席 曾志磊 韩 冰 尹红蕾

1）解放军第148医院神经内科 淄博 255300 2）清华大学玉泉医院神经内科 北京 100049 3）郑州大学第二附属医院神经内科 郑州 450014

多发性硬化（MS）是由淋巴细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、抗体及补体介导的一种中枢神经系统（CNS）的炎症脱髓鞘疾病。巨噬细胞产生细胞因子并激活CD4细胞启动炎症反应成为T辅助细胞，巨噬细胞吸收细胞碎片、蛋白酶并释放细胞因子，在脱髓鞘中起重要作用［1］。

壳多糖酶家族属于18家族糖基水解酶，人类壳多糖酶的壳三糖苷酶（CCTS）在活化的巨噬细胞，尤其病理条件下长期表达。组织巨噬细胞表达高活性的CCTS，引起脂质积聚，在溶酶体脂质紊乱、地中海贫血、镰刀状贫血等病人的血液中，CCTS活性明显升高［2］。活动性 MS病变的特点是血管周围淋巴细胞和单核细胞浸润，由星型胶质细胞产生的巨噬细胞趋化因子，诱导单核细胞从血液向脑组织迁移，并分化为巨噬细胞。斑块中央早期损伤部位为巨噬细胞充填，在慢性活动性MS时，细胞浸润不明显，仅限于斑块周围，充填脂质的巨噬细胞和淋巴细胞围绕在缺少细胞的斑块中央，提示浸润的巨噬细胞和小胶质细胞的活化，使CNS的CTTS活性增加和脑脊液（CSF）内CTTS积聚［3］。我们研究的目的是探讨MS病人CSF中CCTS活性，以及CTTS活性增高与炎症或免疫活化的关系，为MS的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 病例收集 2004－01～2010－12我们在解放军第148医院、清华大学玉泉医院、郑州大学第二附属医院神经内科对诊断为MS的住院病人开展此项试验，排除缺少腰穿（LP）记录、临床资料不完整者，共178例病人入组。根据 MS的诊断标准，符合复发缓解型 MS（RRMS）120例，继发进展型MS（SPMS）32例，原发进展型 MS（PPMS）26例。另外选择40例其他神经疾患（OND），和30非神经疾患病人作为对照组。OND包括脊髓型颈椎病、B12缺乏、血管病、肌萎缩侧索硬化（ALS）、脊髓空洞、脊髓损伤等。对照组病人包括同时间内在上述三所医院腰穿检查排除神经疾病者，包括头痛、良性颅内压增高、无明显原因震颤、发作性感觉丧失、眼睑下垂等，对其血清和CSF中CTTS活性及CSF单核细胞数（MNC）和鞘内IgG产物进行检测。

1.2 方法 所有入组病例在24h内完成体检、辅助检查和生化检查，静脉穿刺收集血液标本，室温下离心5min（1500×g），取上清液分储于－80℃ 冰箱备用。选择第3～4腰椎间隙为穿刺点，穿刺成功后收集CSF，常规检查后将CSF离心5 min（800×g），将上清液分装于小试管内，－80℃ 冰箱冻存备用。待标本收集完成后进行常规酶活性测和CSF及血清壳三糖苷酶检查。简述如下：将冰冻的CSF和血清标本复温，用4MU三乙酰壳三糖孵育2h，CTTS与三乙酰壳三糖形成4甲基伞形酮，加入过量甘氨酸缓冲液终止反应。应用CobasFara荧光定量分析仪（Roch公司，荷兰）测定4甲基伞形酮含量，计算CTTS比率，CTTS比率除以Q白蛋白（CSF和血清白蛋白浓度的比例）来计算CTTS指数。CSF检查的变化系数（CV）在10.6μmol／（h·L）（n＝10）活性时是3.8%，在4.88 μmol／（h·L）（n＝10）活性时为0.66%。血清化验检查中的CV 在52.4μmol／（h·L）（n＝10）时为 1.54%，在 134.3 μmol／（h·L）（n＝10）时为1.55%。CSF化验检查中CVs如下，5.0% （4.8μmol／（h·L），n＝3），血 清 2.2% （118.5 μmol／（h·L），n＝3）。CTTS活性不受性别影响。免疫印迹方法分析CSF和血清寡克隆IgG带，比浊法测定白蛋白和IgG浓度（贝克曼图像分析仪，荷兰）。IgG指数＝（CSFIgG除以血清IgG）／（CSF白蛋白／血清白蛋白），以IgG指数＞0.58为升高。按照Reiber等的方法计算鞘内Ig产物［4］。

1.3 统计学分析 应用SPSS 10.0统计程序软件包完成统计分析，对两组间比较应用秩和检验，多组间比较应用Kruskal－Wallis检验，其他应用post－hoc检验。

2 结果

2.1 临床特点和CSF标志物 RRMS、PPMS、SPMS组与OND组和对照组年龄无明显差异。SPMS和PPMS组扩展残疾状态量表（EDSS）评分高与OND组，而RRMS组不明显。RRMS、PPMS和SPMS组与OND组病程类似。与OND组相比，RRMS、PPMS和SPMS组CSF单核细胞数增高。MS组病人76.5%～95%（全部 MS病人82.6%）CSF发现克隆IgG带，而OND组为8.9%。MS病人IgG指数增高但与鞘内IgG产物的比例降低（见表1）。

2.2 CTTS活性和CTTS指数 MS病人血清CTTS活性与OND组相比无明显不同，但CSF中CTTS活性明显高于OND组（P＜0.001）。MS组CTTS指数也明显高于OND组（P＜0.05）和对照组（P＜0.001）。在全部 MS病人，RRMS和SPMS组CTTS指数与OND和对照组明显升高。按照对照组测定的数值，我们界定CTTS的参考上限（p95＝均数＋2×SD）为0.045，大部分 RRMS、SPMS和P PMS组病人CTTS指数均高于0.047（见表2）。

2.3 CTTS活性与CSF免疫活化及炎症的关系 在RRMS组，CSF伴有MNC增高或寡克隆IgG带病人的CTTS指数高于无MNC增高或寡克隆IgG带病人，这种现象也见于整体MS组。在SPMS与PPMS病人，伴有CSF寡克隆IgG带病人CTTS指数高于无寡克隆IgG带病人，而MNC没有这种关系（见表3）。

表1 临床特点与炎症或免疫活化的CSF标志物比较

表2 CSF与血清CTTS活性和CTTS指数 （）

表2 CSF与血清CTTS活性和CTTS指数 （）

注：（1）RRMS和SPMS组与对照组比较，P＜0.05；（2）SPMS组与OND组比较，P＜0.05；（3）MS组与 OND组比较，P＜0.05；（4）MS组与对照组比较，P＜0.001

表3 CTTS指数与MNC、鞘内IgG产物及寡克隆IgG带 （）

表3 CTTS指数与MNC、鞘内IgG产物及寡克隆IgG带 （）

注：组内比较，癎P＜0.05；组内比较，▲P＜0.01；组内比较，★P＜0.001

3 讨论

我们的研究发现，在 MS病人，RRMS和SPMS病人CTTS指数增高，尤其是RRMS病人CTTS指数更高，认为CCTS指数增高与鞘内免疫活化或炎症有关。人类的CTTS主要来自单核细胞或巨噬细胞家族，包括小胶质细胞，这些细胞活化导致CTTS分泌增加。MS时巨噬细胞或小胶质细胞介导炎症和吞噬作用，因此认为CSF中CTTS活性增高可能是由于鞘内炎症反应或吞噬作用引起。有研究报道，亚洲人群视神经脊髓炎病人活化的CD4阳性T细胞产生白介素－17可引起中性粒细胞的增殖、成熟和趋化性，但仅限于MS的视神经脊髓炎症，而欧洲病人缺乏这种相关性［5］。

以往认为，SPMS病人炎症和免疫活化较RRMS少见，我们发现RRMS和SPMS病人与对照组相比CTTS指数增高，但在SPMS病人，CTTS指数增高仅限于CSF寡克隆IgG带病人，在不伴有IgG指数增高或鞘内产物的SPMS病人，尽管CSF内MNC升高，CTTS没有明显增加。这种现象提示免疫介导的炎症反应并非是SPMS病人CTTS活性增高的主要原因，说明SPMS病人的CSF病理学较RRMS更复杂，无论是MRI对比增强或免疫组织化学显示炎症证据不明显，尸检证实SPMS组织结构紊乱主要是由于退行性变伴有轴突变性［6］。由此推断，与RRMS相比，SPMS病人的CTTS指数增高，可能反应有其他的病理过程参与，并非炎症或吞噬作用等简单的病理过程。

最近欧洲的一项研究报道，MS病人CSF和血浆CTTS活性明显增高，而且SPMS病人血液CTTS活性高于RRMS病人［7］。但我们研究发现MS病人血液CTTS活性不增高，SPMS病人与RRMS相比无明显变化，PMS病人与RRMS相比CSF中CTTS活性轻度升高，但CTTS指数无明显差别。部分原因可能是由于亚洲与欧洲人群之间不同的临床特点造成的，也可能是由于欧洲人群特定的基因或免疫学特点与SPMS病人巨噬细胞或小胶质细胞活性增高有关，确切原因有待进一步研究。另有文献报道，欧洲撒丁岛人群MS的发病机制与特定的人类白细胞抗原（HLA）等位基因有关，且不同HLA亚型的淋巴细胞产生不同的细胞因子［8］。我们总共对178例MS病人，其中包括26例PPMS病人进行研究，而它们的研究为22例MS病人，仅包括2例PPMS病人，样本数远远多于它们的研究报道。我们发现PPMS的CTTS指数没有升高，提示PPMS病人的巨噬细胞或小胶质细胞活性较SPMS病人明显降低。一般情况下，PPMS病人很少有头颅MRI异常，常表现典型的脊髓纵向损害，脊髓损伤常导致残疾，邻近损害部位的蛛网膜下腔CSF检查更易发现CTTS增高，但由于脊髓体积小，周围损伤不明显，这也是PPMS病人CTTS活性没有增高的部分原因。

另外，我们发现82.6%的MS病人CSF出现寡克隆IgG区带，鞘内IgG产物为41.4%，63.5%病人IgG指数增高，低于其他文献报道。由于我们的研究样本来自三家不同的医院，经过临床专家和MRI、CSF和诱发电位检查，包括少数非典型或症状和体征不明显得到确诊的MS病人，与来自单个医院或某一地区其他的报道可能有某些区别。因此，我们的研究发现RRMS和SPMS病人CSF的CTTS指数增高，这种增高与CSF的炎症及免疫活化有关，但其确切机制需要独立的相关研究进一步证实。

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