4种医院制剂微生物限度检查方法验证

宾 驰 颜栋林

（1 浦北县人民医院，广西 浦北 535300；2 广西南宁食品药品检验所，广西 南宁 530001）

药品微生物限度检查是控制医院制剂质量的一项重指标，为了保证测定方法的可靠性，必须按照中国药典2005年版的规定[1]进行方法验证。本文根据制剂抑菌活性的强弱和对不同菌种抑菌程度的大小采用适当的检查方法，加入5种污染菌：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌于4种制剂中，对各试验菌的回收率进行验证，并以加入4种污染菌：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单细胞、沙门菌进行检出实验，从而建立4种医院制剂的微生物限度检查方法。

1 材 料

1.1 样 品

①外用跌打酒（批号：071128，071202，071210）、（2）跌打洗液（批号：071130，071201，071202）、③胆贝蜜汁口服（批号：071201，071204，071207）、④解毒抗白颗粒（批号：081001 ，081002，081003），均由南宁市中医院提供。

1.2 培养基

营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，营养肉汤培养基，胆盐乳糖培养基（BL），改良马丁培养基，改良马丁琼脂培养基，MUG培养基，曙红亚甲蓝琼脂培养基，甘露醇氯化钠琼脂培养基，溴化十六烷三甲胺琼脂培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基，沙门、志贺菌属培养基，由广西食品药品检验所提供。

1.3 试验菌株

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、大肠埃希菌（Escherichia coli） [CMCC（B）44102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、沙门菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC（B）50094]，由广西食品药品检验所提供。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌、铜绿假单胞菌取经35℃培养18～24h的营养肉汤培养物，白色念珠菌取经25℃培养24～48h的改良马丁液体培养物，黑曲霉取经25℃培养1周的改良马丁琼脂斜面培养物加10mL 0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子所得菌液，用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用。

2.2 供试液的制备

液体制剂取原液或固体制剂取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，摇匀，成1:10均匀混悬液作为供试液。常规法：取供试液1mL注皿。

培养基稀释法：（1） 取供试液1mL注入2个平皿（0.5mL/皿）

（2） 取供试液1mL注入5个平皿（0.2mL/皿）

薄膜过滤法：取供试液1mL，采用薄膜过滤法，依法检查，以0.1%蛋白胨水为冲洗液。

2.3 回收率测定

试验组：取供试品原液（或1∶10）1mL注入平皿，每个平皿分别加入上述备用的试验菌50～100CFU，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培养48～72h。

表2 3批样品的试验菌回收率

表3 消除供试品抑菌活性控制菌检查方法验证

表4 4种医院制剂微生物限度检查法

菌液组：取试验菌50～100CFU注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，平行制备2个平皿，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培养48～72h，测定所加入的试验菌数。

供试品对照组：取供试品原液（或1∶10）1mL注入平皿，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培养48～72h，测定供试品本底菌数。

2.4 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证

4种医院制剂各取3个批号样品，细菌数、霉菌和酵母菌数按初步确定方法进行加菌回收试验，结果5种规定试验菌的回收率均＞70%，符合《中国药典》2005年版的规定，表明方法可行。结果见表2。

2.5 控制菌检验方法验证

液体制剂取原液1mL、固体制剂取1:10混悬液10mL及50～100cfu试验菌加入增菌培养基（100mL、200mL、300mL）中，依相应的控制菌检查法[2]进行检验。结果表明随着培养基量的增大，制剂的抑菌活性减弱，控制菌便可检出，说明在常规法不适用的情况下，采用培养基稀释法可达到目的。结果见表3。

2.6 微生物限度检查法建立

根据上述实验结果，建立4种医院制剂微生物限度检查法，结果见表4。

3 讨 论

制剂的微生物限度检查方法验证的目的是保证检验结果的可靠性和准确性，以有效地控制制剂的质量。我们在通过验证建立方法时，应该抱着严谨的态度，不仅要顾及检验方法的科学性，还应该遵从简便易行的原则，避免不必要的资源浪费。微生物限度检查法由简到繁的顺序为常规法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法。在确保检验结果的准确可靠前提下，能用常规法就不推荐用培养基稀释和薄膜过滤法，能用培养基稀释法就不用薄膜过滤法，培养基稀释法能用0.5mL/皿就不必要用0.2mL/皿，薄膜过滤法每膜能用100mL冲洗就不必要用300mL。本文严格按中国药典2005年版规定并遵从简便易行的原则，通过逐步验证建立方法，为4种医院制剂的微生物限度检查法的标准制订提供依据。

[1] ChP(中国药典).Vol II(二部)[S].2005:Appendix(附录)XI J 93-101