丁苯酞对AD大鼠模型海马BACE及NEP活性含量的影响

陈 芸,李海洋

阿尔茨海默病为神经系统退行性疾病,是老年性痴呆的主要类型之一,其发病机制尚未阐明,但较为公认的是Aβ级联假说[1]。Aβ在颞叶、海马的沉积可引起细胞内钙稳态失衡、氧化应激、炎症免疫、细胞凋亡、线粒体损伤、胆碱能系统的损伤等,最终引起神经元的丧失,产生记忆力及认知的下降。因此,Aβ在AD的发病中起着关键性作用,而减少Aβ沉积成为治疗AD的一条重要途径。丁苯酞可以减少AD模型大鼠海马Aβ的沉积[2],其可能机制之一是促进α分泌酶的表达[3],但丁苯酞是否会影响Aβ代谢其他重要途径尚不清楚。β分泌酶(BACE)是Aβ产生过程中第一个限速酶,而中性内肽酶(NEP)是脑内重要的Aβ降解酶。本实验通过检测影响Aβ代谢BACE和NEP,探讨丁苯酞减少AD大鼠模型脑内Aβ沉积的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康雄性Wistar大鼠40只(山西医科大学实验动物中心提供),体重280 g～320 g。随机分为4组:假手术组、模型组、丁苯酞低剂量组、丁苯酞高剂量组,每组各10只,自由进食、饮水,自然昼夜节律光照。

1.2 药品、试剂与仪器 丁苯酞(恩必普,NBP)由石药集团恩必普药业有限公司提供;Aβ1-40蛋白片段(北京博奥森);大鼠脑内β-分泌酶、中性内肽酶活性 ELISA 试剂盒(美国 R&D);江湾1C型脑立体定位仪;FA 2004/1104型电子天平(上海天平仪器厂);玻璃匀浆器(天津科器集团公司);离心机(LD5-2A,北京医用离心机厂);电热恒温培养箱Jc303型(上海成顺仪器仪表有限公司);Wellscan MK-3全自动多功能酶标仪(芬兰 Labsystems Dragon公司)。

1.3 模型建立及给药 采用大鼠海马立体定向注射凝聚态Aβ1-40诱导AD模型[3]。将丁苯酞溶于植物油中,制成浓度为10 mg/mL植物油与药物混合物进行灌胃;根据人和动物按体表面积折算的等效剂量,丁苯酞高剂量组按60 mg/kg给药,丁苯酞低剂量组按30 mg/kg给药,假手术组和模型组大鼠给予等体积植物油,造模手术后第一天即给药,灌胃共4周,均每日1次灌胃。

1.4 海马组织匀浆β分泌酶及中性内肽酶的活性含量测定灌胃满4周后处死大鼠,进行麻醉,快速断头,在冰盘上迅速将两侧海马剥离(右侧海马用以β分泌酶的检测,左侧海马用以中性内肽酶的检测),用冰冷的生理盐水冲净海马表面血迹,滤纸拭干,后以电子天平称重;按1 g∶10 mL冰水溶液中用玻璃匀浆器研磨制成匀浆,4℃3 500 r/min离心10 min,取上清液,制成10%海马脑组织匀浆。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中大鼠海马组织匀浆中β分泌酶及中性内肽酶的活性含量。

2 结 果

2.1 β分泌酶的活性含量(见表1)与假手术组相比,模型组大鼠海马组织匀浆中β分泌酶的活性含量明显增加(P＜0.01);但与模型组比较,丁苯酞低剂量组、高剂量组β分泌酶的活性含量没有明显降低;低、高剂量丁苯酞组β分泌酶的活性含量差异也无统计学意义。

表1 丁苯酞对AD大鼠海马BACE活性含量的影响(±s)

表1 丁苯酞对AD大鼠海马BACE活性含量的影响(±s)

组别 动物数(只)BACE(pg/mL)假手术组 10 23.08±2.70模型组 10 35.41±3.091)丁苯酞低剂量组 10 33.23±3.271)丁苯酞高剂量组 10 33.84±3.611)与假手术组比较,1)P＜0.01

2.2 中性内肽酶活性 与假手术组大鼠相比,模型组大鼠海马组织匀浆的中性内肽酶活性明显增加(P＜0.01);与模型组比较,丁苯酞低剂量组、高剂量组大鼠海马组织匀浆的中性内肽酶的活性含量明显降低;低、高剂量丁苯酞组大鼠海马组织匀浆的中性内肽酶的活性,差异无统计学意义。详见表2。

表2 丁苯酞对AD大鼠中性内酶活性含量的影响(±s)

表2 丁苯酞对AD大鼠中性内酶活性含量的影响(±s)

组别 动物数(只)NEP(pg/mL)假手术组 10 65.17±2.33模型组 10 43.72±3.261)丁苯酞低剂量组 10 62.06±2.452)丁苯酞高剂量组 10 63.23±2.832)与假手术组比较,1)P＜0.01;与模型组比较,2)P＜0.01

3 讨 论

阿尔茨海默病的发病机制虽然尚未阐明,但Aβ在AD发病过程中的重要地位已有广泛共识。Aβ由APP水解产生,它水解途径有两条:第一条以α分泌酶、γ分泌酶水解[4],该途径不产生β淀粉样蛋白,而产生可溶性蛋白 sAPPα[5],这也是APP加工的主要途径。第二条是APP分别由β分泌酶、γ分泌酶水解,该途径产生完整的 Aβ[4,6]。β分泌酶作为 Aβ生成的限速酶,近年来已成为研究痴呆药物的重要靶标[7]。在临床研究中,Holsinger等[8]分析了21例AD患者脑脊液(CSF)中BACE的活性后,发现CSF中BACE活性增强。Zhong等[9]研究了80例痴呆患者,磁共振、免疫组化结果显示,痴呆组BACE浓度比对照组正常人群明显增高。β分泌酶升高在Aβ生成中起着重要作用。抑制β分泌酶将会减少Aβ生成。本实验结果显示,AD模型大鼠海马组织中β分泌酶活性含量明显升高,但却未发现丁苯酞能够减少其β分泌酶的活性含量,丁苯酞抑制Aβ沉积可能不通过减少β分泌酶的活性含量这条途径。

AD的主要发病原因是Aβ的不完全清除(大于98%的AD病例)[10]。NEP是脑内主要的Aβ降解酶,位于细胞轴突和突触膜上,属Zn金属蛋白酶家族,是分子量约为 186KDa的Ⅱ型跨膜糖蛋白,可降解Aβ单体和寡聚体。其表达下调加剧Aβ聚集,表达上调降低脑内Aβ水平;NEP在AD患者脑内老年斑块区域含量最少,而脑周围的功能区域NEP表达基本正常。因此,NEP的降低可以作为AD早期发病的危险因素之一[11],其升高则有利于Aβ降解。本实验研究显示,模型组大鼠海马组织NEP含量明显降低,而用药组大鼠海马组织的中性内肽酶活性含量明显增高,但尚未超过正常组,说明丁苯酞可能通过促进中性内肽酶的活性含量从而加速Aβ的降解,减少Aβ的沉积。

丁苯酞提取于芹菜籽,可能通过保护线粒体的机制改善AD患者的认知。有研究者间断向大鼠脑内注射Aβ,制成AD模型大鼠并给予丁苯酞治疗,结果显示丁苯酞可以通过抑制细胞凋亡、过抗氧化、降低tau蛋白磷酸化等途径改善AD大鼠的认知能力[12]。丁苯酞可以成为治疗阿尔茨海默病潜在的治疗药物,并可能通过多机制、多靶点改善阿尔茨海默病记忆及认知功能。而减少Aβ的沉积能从根本上抑制Aβ的神经毒性。Aβ有一个生成和降解的平衡过程,正是由于这个生成与降解的过程发生异常使Aβ在脑部增多、沉积。丁苯酞可以减少Aβ的沉积,改善AD模型大鼠的认知。其可能的机制之一是通过促进α分泌酶的表达,将 APP裂解为可溶性的APP片段sAPPα,减少APP分解为Aβ[3]。结合本实验,丁苯酞也可能通过促进中性内肽酶的活性含量,加速Aβ的降解,从而恢复Aβ生成和降解的平衡,即抑制Aβ的生成,促进 Aβ的降解,最终减少 Aβ的沉积。但是否还有其他机制的参与有待更进一步的研究。

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