多菌种混合发酵棉籽饼粕制备益生菌生物活性饲料

王小磊 高 冰 杨欢欢 陈 璐

目前，我国蛋白质饲料资源严重匮乏，自给率不足50%，并且由于动物性蛋白供应日趋紧张，使得植物性蛋白饲料在饲料中的应用逐渐增加。用量最大、也是最为重要的一类植物性蛋白质饲料是饼粕类。其中棉籽饼粕富含蛋白质，是很好的动物饲料蛋白资源。

我国是产棉大国，年产棉l 000万以上。棉籽经榨油后得到的饼粕中含蛋白质30%～40%，且其蛋白质的氨基酸成分比较完全，另外棉籽饼粕还含有糖、脂肪、磷脂、维生素、纤维素等，可作为优质的饲料资源。但是，因其含有对动物有毒的游离棉酚，其利用价值和使用量受到极大限制，故我国棉籽饼粕饲料的利用率不足30%，从而也制约着我国畜牧业生产的发展。

近年来，随着对棉籽饼粕生物脱毒法的不断研究与改进，脱毒工艺已经由单菌种发酵脱毒发展到多菌种混合发酵脱毒。吴伟伟应用酵母菌等菌种，熊巍等应用地衣芽孢杆菌等多菌种混合发酵棉籽饼粕后，脱毒率均达90%以上。因此，采用微生物发酵法，不仅能安全脱毒，还能提高棉籽饼粕营养价值，使其更好地应用于畜牧业。发酵过程中适当应用益生菌，已受到越来越多的关注。

益生菌不仅能促进饲料中营养素降解，使动物对饲料的吸收利用更充分，还具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖，促进动物生长，调节胃肠道正常菌群、维持微生态平衡，从而改善胃肠道功能，提高食物消化率和生物效价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长，提高机体免疫力。

本研究拟采用地衣芽孢杆菌、乳酸菌、酿酒酵母等菌种对棉籽饼粕进行发酵，以去除棉籽饼粕中的游离棉酚及降解棉籽饼粕中大分子蛋白和降低抗营养因子的含量，并且生产的饲料中含有大量益生菌、蛋白酶、短肽和乳酸等生物活性物质，最终得到一种有利于动物消化吸收和生长发育等功效的生物活性饲料。由于本研究组对于多菌种混合发酵棉籽饼粕脱除游离棉酚的研究已经较成熟，因此，本研究重点介绍在脱毒基础上的益生菌生物活性饲料的生产。

1 材料与方法

1.1 菌株及原料

霉菌XH001、霉菌XH002、地衣芽孢杆菌E01、枯草芽孢杆菌E02、乳酸菌SR01均为武汉工业学院生工院409实验室保藏菌种；酿酒酵母和饲料酵母购自湖北安琪酵母股份有限公司；棉籽饼粕、麸皮、苹果渣均由湖北凤池实业有限公司提供。

1.2 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，水1000 ml，pH值自然。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3 g、蛋白胨1 g、氯化钠 0.5 g、琼脂 2 g、蒸馏水 100 ml，pH 值 7.0～7.2。

MRS培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖 20.0 g、吐温 801.0 ml、磷酸氢二钾 2.0 g、乙酸钠 5.0 g、柠檬酸三铵 2.0 g、硫酸镁 0.2 g、硫酸锰0.05 g、琼脂粉 15.0 g，蒸馏水 1000 ml，pH 值 6.2。

1.3 检测指标

1.3.1 有效活菌数的检测

霉菌、芽孢杆菌、乳酸菌计数采用平板稀释涂布法，分别用PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基和MRS培养基，涂布平板培养，数菌数。酵母菌数的测定按GB／T4789.15—2003 执行。

1.3.2 粗蛋白和氨基酸态氮的检测

氨基酸态氮含量的测定采用甲醛滴定法，粗蛋白含量的测定采用凯氏定氮法。

1.4 原料配比

原料由60%饼粕、20%苹果渣、20%麸皮组成。各原料粗蛋白含量见表1。混合后原料粗蛋白含量为27.58%。

表1 原料的粗蛋白含量

1.5 工艺流程

工艺流程说明：混合均匀后的原料按1：1加水后进行蒸煮，蒸煮后原料含水量为50%左右，接种发酵，霉菌与酵母菌发酵一段时间后接入芽孢杆菌(E01：E02=1：1)，继续发酵12h后接入乳酸菌种子液，继续发酵24 h，然后在45℃下低温干燥至饲料含水量小于15%。

1.6 发酵条件研究

1.6.1 霉菌与酵母菌接种比例的研究

两种霉菌接种量相同，两组酵母菌接种量相同。霉菌与酵母菌接种比例分别为1：0.8、1：1和1：1.2，在霉菌与酵母菌发酵12 h后接入芽孢杆菌 (E01：E02=1：1)，然后按上述工艺流程进行。每个处理取100 g固体发酵料接种，装入塑料筐中，覆盖纱布后放入恒温、恒湿培养箱内培养，发酵结束后检测各菌种菌数、粗蛋白及氨基酸态氮含量。

1.6.2 芽孢杆菌接入时间的研究

分别于霉菌、酵母菌混合发酵8、12、16 h后接入芽孢杆菌 (E01：E02=1：1)继续发酵12 h后接入乳酸菌种子液，按上述工艺流程进行。每个处理取100 g固体发酵料接种，装入塑料筐中，覆盖纱布后放入恒温、恒湿培养箱内培养，发酵完成后检测各菌种菌数、粗蛋白及氨基酸态氮含量。

1.6.3 乳酸菌接种量的研究

霉菌与酵母菌接种比例为1：1，发酵12 h后接入芽孢杆菌(E01：E02=1：1)，继续发酵24 h后乳酸菌种子液接种量分别为5%、10%、15%，然后按上述工艺流程进行。每个处理取100 g固体发酵料接种，装入塑料筐中，覆盖纱布后放入恒温、恒湿培养箱内培养，发酵完成后检测各菌种菌数、粗蛋白及氨基酸态氮含量。

1.6.4 综合条件的研究

对于发酵条件研究，采用5因素、4水平正交试验。

2 结果与讨论

2.1 霉菌与酵母菌接种比例对发酵结果的影响(见表2)

表2 霉菌与酵母菌不同接种比例后发酵效果

由表2可以看出，不同接种比例接种发酵后，饲料粗蛋白含量无显著变化(P>0.05)，氨基酸态氮及活菌数亦无显著变化 (P>0.05)。但是接种比例为1：1时，发酵结果较好。

2.2 芽孢杆菌接入时间对发酵结果的影响(见表3)

表3 不同芽孢杆菌接入时间对发酵结果的影响

由表3可以看出，芽孢杆菌(E01：E02=1：1)的接入时间对发酵后粗蛋白含量、氨基酸态氮含量及有效活菌数的影响显著(P＜0.05)。同时可以看出，在霉菌和酵母菌发酵12 h后接入芽孢杆菌，发酵效果更好，且发酵后饲料粗蛋白含量显著增加。

2.3 乳酸菌接种量对发酵结果的影响(见表4)

表4 不同乳酸菌接种量对发酵结果的影响

由表4可以看出，乳酸菌接种量的不同对发酵后粗蛋白含量、氨基酸态氮含量及有效活菌数的影响显著(P＜0.05)。当乳酸菌接种量为10%时，发酵效果最佳。

2.4 工艺条件的确定

根据单因素试验，设计5因素（温度、原料含水量、芽孢杆菌接入时间、乳酸菌接种量和发酵时间）4水平L16(45)的正交试验进行发酵工艺条件的优化。由于在早期发酵试验中发现霉菌与酵母菌接种比例对于后期多菌种混合发酵影响不大，故正交试验中忽略此因素的影响，而是增加了发酵的几个基础因素如温度、原料含水量和总发酵时间。正交试验因素水平设计如表5所示，正交试验结果分析见表6。

表5 发酵工艺条件

由表5可知，影响粗蛋白含量的最佳发酵条件为A3B3C3D2E2，即发酵温度为32℃，原料含水量为50%，芽孢杆菌接入时间为发酵后12 h，乳酸菌接种量为10%，发酵时间为48 h，与单因素试验结果相同。同时，对发酵结果的影响因素为A＞B＞C＞E＞D，即发酵温度＞原料含水量＞芽孢杆菌接入时间＞发酵时间＞乳酸菌接种量。

验证试验后，发酵饲料粗蛋白含量达到37.92%，氨基酸态氮含量为1.88%，乳酸菌活菌数达2.3亿cfu/g（干基），芽孢杆菌达18.4亿cfu/g（干基）。

3 结论与展望

本试验以棉籽饼粕与苹果渣、麸皮混合为原料，加水后对原料进行蒸煮，待冷却后接入菌种进行混合菌种发酵，最佳工艺条件为：发酵温度为32℃，原料含水量为50%，芽孢杆菌(E01：E02=1：1)接入时间为发酵后12 h，乳酸菌接种量为10%，发酵时间为48 h。发酵后饲料粗蛋白含量由原来的27.58%提高到37.92%，氨基酸态氮含量为1.88%，乳酸菌活菌数达2.3亿cfu/g（干基），芽孢杆菌达18.4亿cfu/g（干基）。

益生菌生物活性饲料的感官及适口性有很大改善，以后将对此进行更深一步的研究。本研究的应用及推广，将极大提高棉籽饼粕的利用率，促进对益生菌饲料的研究，改善我国蛋白饲料资源匮乏的局面，更好地促进我国畜牧业的发展。

若干篇，刊略，需者可函索）