乳酸菌固态混合发酵研究

方芳 张恒 贾建波 赵玉萍 张海宁 吕华清

生物饲料，即微生物饲料，是在微生态理论指导下采用已知有益的微生物与饲料混合，经发酵、干燥等特殊工艺制成的含活性益生菌的安全、无污染、无残留的优质饲料，与发酵前相比，营养价值提高了，抗营养因子减少了，对动物有一定的促生长作用，可以用来喂猪、鱼、鸭等[1-3]。保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌由于具有调节肠道、促进消化等功能,被众多学者认为是生产益生菌剂的理想菌种。目前对于这三种乳酸菌分别进行固态发酵的研究已有一些报道[4-5]，但对此进行混菌固态发酵的研究还不多见[6]。因此本实验选用玉米粉、麦麸、豆粕这些市场上易购的廉价饲料原料作为固态基质，对这三种乳酸菌进行固态混合发酵，优化固态发酵条件，测定发酵产物的粗蛋白质、粗脂肪和氨基酸态氮含量，为开发一种新型生物饲料打下基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

保加利亚乳杆菌 (Lactobacillus Bulgaria,以下简称 LB)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus,以下简称LA)和嗜热链球菌(Streptococcus thermopiles,以下简称ST)由淮阴工学院微生物实验室提供。

1.2 仪器设备

恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、消化炉、定氮仪、分光光度计、索氏提取器等。

1.3 培养基

LB、LA和ST的活化用MRS液体培养基。

固态发酵培养基：①玉米粉：豆粕：麦麸=2：1：1；②玉米粉：豆粕：麦麸=1：2：1；③玉米粉：豆粕：麦麸=1：1：2；④玉米粉：豆粕：麦麸=1：1：1；均添加 5%的葡萄糖、MgSO4·7H2O 0.3 g、MnSO4·4H2O 0.15 g。

LB、LA和ST的活菌数测定采用BBL培养基，参照辛若竹等[7]的测定方法。

1.4 固态发酵培养条件的优化

先对固态基质4种不同配比、接种量（6%、8%、10%、12%）、培养基初始含水量（60%、70%、80%、90%）、培养基初始 pH 值（5.0、5.7、6.3、7.0）和发酵温度（35、37、40、42℃）分别进行单因素试验，再对后4个因素进行L9(34)正交试验（因素水平见表1），以LB、LA和ST三种菌活菌数的平均值为指标确定固态发酵条件的最佳组合[8-11]。

表1 正交试验因素水平

1.5 发酵产物常规营养成分测定[12-14]

粗蛋白含量的测定：采用凯氏定氮法；氨基酸态氮含量的测定：采用甲醛法；粗脂肪含量测定：采用索氏提取法。

2 结果与分析

2.1 固态基质不同配比对混合菌种发酵影响

在每个三角瓶固态基质总质量为40 g，培养基初始含水量为70%、pH值为5.7、接种量为8%、LB、LA和ST接种比例为1：1：1、发酵温度为37℃、静置培养4 d的条件下，比较研究了固态基质4种不同配比对乳酸菌固态混合发酵的影响。由图1可以看出，LB、LA和ST的最适固态基质配比分别为④、③、④。从综合评分来看，三种菌混合固态发酵的最适固态基质配比为④，其次为②、③、①。因此，当玉米粉：豆粕：麦麸=1：1：1时，营养配比最适于三种菌的共同生长。

图1 固态基质不同配比对乳酸菌固态混合发酵的影响

2.2 接种量的选择

图2 接种量对乳酸菌固态混合发酵的影响

在玉米粉：豆粕：麦麸=1：1：1、培养基初始含水量为70%、pH值为5.7，LB、LA和ST接种比例为1：1：1、发酵温度为37℃、静置培养4 d的条件下，比较研究了不同的接种量对乳酸菌固态混合发酵的影响。由图2可以看出,在接种量为6%时三种菌生长都很少,随着接种量的增加,三种菌基本都呈先增加后减少的趋势,且在接种量为10%时综合评分达到最大值。因此,选择10%为此固态发酵的最佳接种量。由此可见，在一定的接种量范围内,增大接种量可使菌体数快速增长,增加发酵中的活菌数,缩短发酵周期；但如果接种量太大,培养基中营养物质不能满足菌体生长需要,进而会限制菌体的生长，使发酵后的活菌数减少[8]。

2.3 培养基初始含水量的选择

在玉米粉：豆粕：麦麸=1：1：1、培养基初始pH值为5.7、接种量为10%，LB、LA和ST接种比例为1：1：1、发酵温度为37℃、静置培养4 d条件下，比较研究了培养基不同的初始含水量对乳酸菌固态混合发酵的影响。由图3可以看出,随着培养基初始含水量的增大,发酵后的三种菌数都呈先增加后减少的趋势,且都在含水量为80%时达到最大值。这是因为如果固态发酵培养基初始含水量过高,会使培养基黏度增大,导致培养基通透性降低,使菌体生长缓慢;而含水量过低,则水分供应不足,也会限制菌体的生长繁殖,进而影响发酵效果。因此,选择80%的含水量作为三菌混合固态发酵培养基最佳的初始含水量[8]。

图3 培养基初始含水量对乳酸菌固态混合发酵的影响

2.4 培养基初始pH值的选择

图4 培养基初始pH值对乳酸菌固态混合发酵的影响

在玉米粉：豆粕：麦麸=1：1：1、培养基初始含水量为80%、接种量为10%，LB、LA和ST接种比例为1：1：1、发酵温度为37℃、静置培养4 d条件下，比较研究了培养基不同的初始pH值对乳酸菌固态混合发酵的影响。不同微生物生长所需的适宜pH值不同，LB生长适宜pH值为5.8～6.2[10]，LA生长适宜pH值为 5.5～6.2[8－9]，ST 生长适宜 pH 值为 6.5～7.0[11]。由图 4可以看出,LB和LA在pH值为5.7时分别达到最大值 3.2×109CFU/g和 4.9×109CFU/g，而 ST 则在 pH 值为6.3时达到最大值4.6×109CFU/g。通过综合评分，选择pH值5.7为三菌混合固态发酵培养基最佳初始pH值。

2.5 发酵温度的选择

在玉米粉：豆粕：麦麸=1：1：1、培养基初始含水量为80%、pH值为5.7、接种量为10%，LB、LA和ST接种比例为1：1：1、静置培养4 d条件下，比较研究了不同的发酵温度对乳酸菌固态混合发酵的影响。不同微生物生长所需的适宜温度不同,LB生长适宜温度为 37～42 ℃[10]，LA 生长适宜温度为 35～37 ℃[8－9]，ST生长适宜温度为40～42℃[11]。由图5可以看出，LB在40℃时达到最大值3.2×109CFU/g，LA在37℃时达到最大值4.9×109CFU/g，ST则在42℃时达到最大值5.7×109CFU/g。通过综合评分，选择温度40℃为三菌混合固态发酵的最佳发酵温度。

图5 发酵温度对乳酸菌固态混合发酵的影响

2.6 正交试验

以发酵后的活菌数为指标,在单因素试验的基础上，在玉米粉：豆粕：麦麸=1：1：1、LB、LA和ST接种比例为1：1：1、静置培养4 d的条件下，选择接种量、培养基初始含水量、培养基初始pH值和发酵温度4个因素进行L9(34)正交试验（因素水平见表1），结果如表 2 所示。可以看出 RB＞RC＞RA＞RD，所以培养基初始含水量对于本试验的影响最显著，其次是培养基初始pH值、接种量，最后是发酵温度。通过综合评分，得出最优发酵方案为A2B3C3D2，即接种量10%、培养基初始含水量80%、pH值6.3、发酵温度40℃。但是最优发酵条件并没有出现在9组试验中，为了证实理论分析，进行补充试验。在此优化方案下进行乳酸菌固态混合发酵后，LB数达到3.0×109CFU/g,LA数达到 4.6×109CFU/g,ST 数达到 5.8×109CFU/g，都优于其他小组，表明最优发酵条件成立。

2.7 发酵产物常规营养成分测定(见表3）

由表3可以看出，发酵后的固态基质（玉米粉、麦麸和豆粕）中粗蛋白含量是发酵前的1.16倍，提高了基质的蛋白质水平，而且部分蛋白质转化为菌体蛋白，改变了基质蛋白质的营养品质；氨基酸态氮含量是发酵前的6.94倍，可见乳酸菌的发酵作用能将基质中的大分子蛋白降解为动物更易消化吸收的小分子氨基酸，可明显改善动物对基质的利用率[15]。此外，发酵后的固态基质中粗脂肪含量是发酵前的1.12倍，提高了基质的脂肪水平，能更好地满足动物对必需脂肪酸等脂肪类物质的需求。

表2 正交试验方案及结果

表3 发酵前后固态发酵培养基中营养成分的比较

3 结论

通过单因素和正交试验优化了LB、LA和ST这三种菌的混合发酵条件,得到固态发酵的最佳条件为：固态基质中玉米粉：豆粕：麦麸=1：1：1、培养基初始含水量80%、pH 值6.3、接种量为10%，LB、LA和ST接种比例为1：1：1、发酵温度40℃。在此最适条件下，LB 数为 3.0×109CFU/g,LA 数为 4.6×109CFU/g，ST 数为 5.8×109CFU/g。

LB、LA和ST混合发酵后,发酵产物中不仅含有大量益生菌,而且也使得发酵产物中粗蛋白质、氨基酸和粗脂肪等营养物质含量增多,使得混合发酵产物作为一种生物饲料产品的研制和产业化具有很好的前景。

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