不同氧需求特性菌株在模拟肠道厌氧条件下的增殖

呼慧娟 范小燕 周 琳 杨彩梅

益生菌在饲料行业中的应用，已经有多年的历史。许多试验证明，在合适的时候添加正确的菌株，对于改善动物肠道健康是有益的[1-2]。然而，不同的益生菌具有不同的生物学特性。从其对氧气的需求特性来看，益生菌可分为好氧型、兼性厌氧型和严格厌氧型。在当前应用的益生菌中，芽孢杆菌的使用最为广泛。其中，好氧的枯草芽孢杆菌、兼性厌氧的地衣芽孢杆菌和严格厌氧的丁酸梭菌最具代表性。

在畜禽饲料中添加益生菌的关键在于含有益生菌的饲料进入动物消化道后益生菌的代谢能力。芽孢杆菌在体内的作用过程是：芽孢活化为营养体，营养体大量增殖并代谢。无论芽孢是否活化为营养体，还是营养体是否会大量增殖，最关键的问题在于是否有良好的条件促使这个过程进行。动物消化道中的条件是一定的，而问题在于外源益生菌能否适应动物的消化道环境。动物的消化道中，从胃部到直肠，微生物呈几何数量级增加，99.9%的肠道益生菌在回肠后段。也就是说，益生菌最主要的作用部位是在回肠后段至结肠段，而这些部位基本上是厌氧环境。所以，外源益生菌如果能够起作用，就要适应动物肠道的厌氧环境。从氧气需求特性来看，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和丁酸梭菌显然是不一样的，其在肠道厌氧区的表现自然也会不同。这种不同，将会直接体现在益生菌的使用效果上。同时，其在动物肠道中的表现，也是确定其最适添加量的关键因素。

本试验根据当前动物饲料中常见添加量来确定试验的初始菌株数量，通过肠道模拟来实现基本的厌氧环境，分别测定厌氧的丁酸梭菌、兼性厌氧的地衣芽孢杆菌和好氧的枯草芽孢杆菌3种典型的益生菌株的增殖情况，为益生菌在动物生理条件下的应用提供科学的试验依据。

1 试验材料

1.1 菌种

枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌3种菌株由浙江惠嘉生物科技有限公司菌种室提供，并经16S rRNA测试鉴定。

1.2 培养基

1.2.1 种子培养基

牛肉膏蛋白胨液体培养基（枯草芽孢杆菌用）：蛋白胨 1 g、氯化钠 0.5 g、牛肉膏 0.3 g、水 100 ml，pH 值7.0，121℃、20 min灭菌备用。

地衣芽孢杆菌种子培养基：0.5%氯化钠、5%葡萄糖、1%蛋白胨、1%牛肉膏、水100 ml，pH值7.0，121℃、20 min灭菌备用。

RCM培养基（丁酸梭菌用）：胰蛋白胨1%、酵母粉0.3%、牛肉浸粉1%、葡萄糖0.5%、可溶性淀粉0.1%、氯化钠0.5%、无水乙酸钠0.3%、半胱氨酸盐0.05%，pH值7.0、水 1000 ml，121 ℃、20 min灭菌备用。

1.2.2 生产培养基

枯草、地衣芽孢杆菌：葡萄糖1%，豆粕粉2.5%，硫酸锰、硫酸镁等矿物元素约1.0%（部分配方略），初始pH值7.0。

丁酸梭菌：2%葡萄糖，豆粕4.5%，硫酸铵、碳酸氢钠、硫酸锰矿物元素约0.3%（部分配方略），初始pH值7.0。

2 试验方法

2.1 不同菌株的菌种活化

枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别活化：将菌种冻干管分别转接至对应的种子培养基中（100 ml摇瓶），置37℃、180 r/min培养18 h后，按1%的接种量转接至另一管种子培养基中，37℃、180 r/min培养12 h。

丁酸梭菌活化：冻干管保藏菌株接种于装有RCM培养基试管中，37℃静止厌氧培养24 h，置80℃水浴10 min后，按1%的接种量转接至另一管RCM培养基中，37℃厌氧静止培养16 h。

2.2 不同菌株的厌氧培养

2.2.1 枯草、地衣芽孢杆菌厌氧培养

将活化的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别接种至装有约18 ml液体生产培养基的试管中，每种菌做9～12个试管，接种至试管后保持初始菌数在106cfu/ml，维持pH值，置于厌氧培养箱中进行厌氧培养。

2.2.2 丁酸梭菌厌氧培养

将活化的丁酸梭菌接种至装有约18 ml丁酸梭菌生产培养基的试管中，9～12个重复，保证接种后菌数为104cfu/ml，维持pH值，置于厌氧培养箱中进行厌氧培养。

2.3 培养条件

地衣、枯草、丁酸三株菌均在37℃、摇床上80 r/min条件下厌氧培养，培养过程中，每隔特定时间，即在培养的第 0、4、8、12、16、20、28、34、48 h 取一个试管摇匀，测定一次菌落数，至菌数不再变化时停止检测。

2.4 菌种活化结果预测

为保证接入厌氧培养试管中的菌种数量符合要求，需在正试前预测菌种活化后的活菌数量，预测时菌种培养方法同菌种活化。

3 试验过程

3.1 菌种预测

根据菌种活化过程进行检测：枯草和地衣芽孢杆菌活化后菌数检测结果为5亿cfu/ml，丁酸梭菌活化后菌数检测结果为5千万cfu/ml。

3.2 厌氧培养测定

3.2.1 枯草和地衣芽孢杆菌培养(见表1)

表1 枯草、地衣芽孢杆菌接种量测算

将活化的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌（预测菌数为5×108cfu/ml）进行10倍稀释，取稀释液0.4 ml接种至装有18 ml液体生产培养基的试管中，每个菌做9根试管，置于厌氧培养箱中37℃培养。

3.2.2 丁酸梭菌培养(见表2)

表2 丁酸梭菌接种量测算

将活化的丁酸梭菌（预测菌数为5千万cfu/ml）进行100倍稀释，取稀释液0.4 ml，接种至装有18 ml生产培养基的试管中，9个重复，置于厌氧培养箱中37℃培养。

4 结果与分析

4.1 3株菌株在模拟肠道厌氧条件下增殖计数结果(见表 3)

表3 3株菌株模拟肠道厌氧条件下增殖计数结果(cfu/ml）

4.2 菌株生长曲线

运用EXCEL分析软件，以时间为横坐标、菌数对数值为纵坐标绘制菌体生长曲线（见图1）。

图1 3株菌株在模拟肠道条件下增殖曲线

由表3和图1可知：在模拟肠道厌氧条件下，枯草芽孢杆菌维持在106数量级，几乎不能生长繁殖；地衣芽孢杆菌由106数量级增殖到108数量级，相比枯草芽孢杆菌有所提高，但在培养20 h时才接近增殖高峰，而且没有明显的快速增殖期；丁酸梭菌由104数量级增殖到108数量级，呈现出非常旺盛的繁殖速度，从开始培养就表现出快速增长的趋势，第12 h就达到稳定，接近增殖高峰。

5 讨论

本试验结果表明：好氧的枯草芽孢杆菌在模拟肠道条件下生长微弱或者几乎不生长。由于动物的后消化道环境更接近于无氧环境，所以好氧的枯草芽孢杆菌并不适合肠道环境，其在肠道环境中的增殖也非常有限。

兼性厌氧的地衣芽孢杆菌在模拟肠道条件下有一定生长，从106仅增殖到108数量级。相对来说，地衣芽孢杆菌比枯草芽孢杆菌更能适应动物的肠道环境。地衣芽孢杆菌没有明显的快速增殖期，在培养20 h时才接近增殖高峰。

严格厌氧的丁酸梭菌呈现出非常旺盛的繁殖速度，由104数量级增殖到108数量级，从开始培养就表现出快速增长的趋势，培养12 h就达到稳定，接近增殖高峰。

从本试验我们可以发现，丁酸梭菌最适应模拟肠道的无氧环境，可在肠道中迅速增殖。相对于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，严格厌氧的丁酸梭菌在动物肠道环境中的应用有着天然的优势。大量试验也证明了丁酸梭菌能有效调节肠道菌群平衡，改善生长性能。刘来亭等[3]发现，在肉仔鸡日粮中添加0.3%～0.9%的丁酸梭菌，能够不同程度地提高肉鸡平均日增重，降低发病率和死淘率，添加0.6%和0.9%丁酸梭菌显著提高肉鸡肠道绒毛长度（P＜0.05）。王保正等[4]试验结果表明，在哺乳仔猪教槽料中提前添加丁酸梭菌对猪的生长发育大有益处。丁酸梭菌在肠道内增殖代谢产生大量生物丁酸，可以改善和治疗肠道疾病。吴小平等[5]研究表明，丁酸梭菌可有效治疗溃疡性结肠炎。朱晓慧[6]、谢树贵[7]等报道，丁酸梭菌对动物肠道有益菌有增殖作用和共生关系，对致病菌有拮抗作用，这主要是由于丁酸梭菌在动物肠道中大量增殖，产生了较多的有益代谢产物，而最主要的产物——生物丁酸，对于结肠炎的治疗和结肠中的菌群平衡具有显著作用。

许多报道认为地衣芽孢杆菌对动物生产性能的改善有一定的效果[8－9]。地衣芽孢杆菌在肠道无氧条件下虽然没有明显的快速增殖期，而且达到增殖高峰的时间也较长，但有适度的增殖量，能够适应肠道厌氧环境，并产生有益的代谢产物，其通过产酶、夺氧等作用方式，可在一定程度上调整肠道菌群平衡，影响肠道的消化能力。

枯草芽孢杆菌在畜禽养殖上的应用虽有一定的积极效果[10－11]，但由于其不适应动物肠道的无氧环境，因此不能进行有效的增殖代谢来调整肠道菌群平衡，也不会因肠道功能的改善而提高动物的生长性能。而枯草芽孢杆菌的一些积极作用，可能是源于其在固态发酵生产过程中产生的代谢产物。例如，由于它能分泌多种酶类和抗生素，对养殖水体的改善和病原菌的抑制起到一定作用[12－13]。所以，枯草芽孢杆菌的作用特点，与其说是益生菌本身的作用，不如说是其体外代谢产物的作用。另外，由于枯草芽孢杆菌的好氧特性，可消耗肠内过量的气体，造成厌氧环境，以利于厌氧菌繁殖。

6 小结

①在厌氧条件下，丁酸梭菌菌数从接种时的104cfu/ml短时间内即可增殖到108数量级，可见丁酸梭菌能充分适应肠道的厌氧环境；

②地衣芽孢杆菌增殖到108cfu/ml，但由于其初始接种数量为106cfu/ml，与丁酸梭菌相比，其在厌氧条件下增殖速度不如丁酸梭菌；

③枯草芽孢杆菌在厌氧条件下，仅维持到106cfu/ml，有研究表明，当一种菌在肠道内的增殖仅在107数量级及以下时，其产生的代谢产物不足于对肠道健康产生影响。可见，由于其好氧特性，枯草芽孢杆菌在肠道的适应性方面存在先天不足。

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