饲料中添加三聚氰胺对吉富罗非鱼生长、免疫指标及肌肉残留量的影响

汤菊芬 吴灶和 简纪常 鲁义善 王 蓓

三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料，其含氮量高达66%左右。学名为三氨三嗪,又称三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。俗称蜜胺、蛋白精。由于目前测定食品和饲料工业蛋白质含量的凯氏定氮法，只能测出含氮量而无法测出氮的来源，故含氮量远远高于蛋白质的三聚氰胺被不法商人掺杂进食品或饲料中，不仅对养殖动物健康和养殖业产生不利影响，对人类健康也存在着潜在威胁。有关三聚氰胺对动物的毒性研究,哺乳动物研究报道较多，三聚氰胺对鱼类的毒性研究大部分为急性毒性研究报道或鱼组织中三聚氰胺及其类似物的检测方法，三聚氰胺对鱼类生长、免疫功能及肌肉组织残留等方面的系统研究报道还很少。本试验以目前广东省主要淡水养殖鱼类——吉富罗非鱼为研究对象，通过在饲料中添加不同剂量的三聚氰胺，喂养吉富罗非鱼28 d，探讨三聚氰胺对吉富罗非鱼生长、免疫功能及肌肉残留量的影响，旨在为三聚氰胺在水产饲料中的安全性评价提供理论依据。

1 方法与材料

1.1 三聚氰胺

试验所用三聚氰胺为上海凌峰化学试剂公司生产，白色粉末状，纯度≥98.5%。

1.2 试验饲料

参照刘海燕等[1]毒性试验结果，将三聚氰胺分别按 0、500、2000、5000、10000 mg/kg 的比例添加于基础饲料（原料组成见表1）中，混匀后，用双螺杆制粒机挤压成粒径为2 mm的5种颗粒饲料，风干后放入－20℃冰箱中保存备用。

表1 基础饲料主要成分含量(%)

1.3 试验用鱼及饲养管理

挑选外观正常，体质健壮，尾均体重为 (30.14±0.22)g的吉富罗非鱼作为试验用鱼。养殖试验在广东海洋大学湛江东海岛高新科技园的5个水泥池内进行，每个水泥池挂 3个网箱（规格：1 m×1 m×0.8 m）作为一个处理，每个处理设3个重复，每个网箱放养吉富罗非鱼30尾，水泥池水深为1 m。试验用鱼先暂养7 d后，称初始体重，然后平均分组。试验组分别投喂添加三聚氰胺的饲料，对照组投喂基础饲料，每天于09：00和17：00投喂饲料，日投饵量为鱼体重的3%～5%。为便于观察罗非鱼的摄食情况，每个网箱挂一个投饵台。投饵后半小时检查投饵台中的饲料，如有剩余及时清理，并调整下一次的投饵量；每周根据鱼的生长状况，相应地调节投饲量，称终末体重前24 h停止投喂。试验全过程不间断充气增氧，每天换水1次，换水量为 2/3。水温为(33.5±1.5)℃，养殖试验持续28 d。

1.4 样品的采集和保存

每周从每个网箱中随机抽取5尾吉富罗非鱼，先称重，用于计算相对增重率。然后尾静脉采血，置于Eppendorf管中，室温下静置1 h，待其凝固后,置4℃冰箱过夜，5000 r/min，4℃离心10 min,收集血清，－80℃下保存备用，用于血清免疫指标测定。最后，将罗非鱼体表用抹布擦干，去鳞、去鳃、去内脏，去除鱼皮，取其两侧侧线上的背肌肉，5尾鱼的肌肉合为一个样品，放于无菌密封袋中，立即用液氮快速冷冻，然后转至－20℃的冰箱中保存，用于肌肉成分测定。

1.5 指标测定

1.5.1 相对增重率测定

相对增重率(%)=[(试验末鱼体重－试验初鱼体重)/试验初鱼体重]×100。

1.5.2 血清溶菌酶（LSZ）活力测定

溶菌酶的活力测定采用试管法,按Hultmark等[2]方法进行。用0.1 mol/l的磷酸钾盐缓冲液将溶壁微球菌配成悬液(OD570≈0.3),取3 ml悬液于试管内冰浴,再加入50 μl待测样品,混匀后测其吸光度(A),然后将试管于37℃温浴30 min后(保温过程中要不停地振荡),取出冰浴10 min以终止反应,测吸光度(A0)。并按下面公式计算：

溶菌酶活力UL(相对酶活)=(A0－A)/A。

1.5.3 血清超氧化物歧化酶（SOD）活力测定

SOD活力用南京建成生物工程研究所提供的测试盒测定，具体测定步骤按说明书进行。

1.5.4 血清碱性磷酸酶（AKP）活力测定

AKP活力用南京建成生物工程研究所提供的测试盒测定，具体测定步骤按说明书进行。

1.5.5 肌肉中三聚氰胺残留量测定

用高效液相色谱法测定，参照刘永涛等[3]方法稍加修改。

①样品处理：称取5 g(精确至0.01 g)样品于50 ml离心管内，准确加入10 ml提取液，涡旋混合均匀1 min，振荡提取20 min，静止2 min后，于5000 r/min的离心机上离心10 min，取上清液2 ml转移至2 ml离心管中，于8000 r/min的高速离心机离心8 min。取上清液过0.2 μm滤膜上机测定。

②色谱条件：色谱柱DIKMA C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈： 离子对试剂溶液=8+92(v/v)；流速为1.2 ml/min；检测波长236 nm；柱温40℃；进样量 20 μl；流动相使用前过0.45 μm 滤膜。

1.6 数据统计与分析

采用SPSS11.5分析软件对样本进行单因素方差分析(one－way ANOVA)和Duncan's法多重分析。大写字母表示差异极显著（P＜0.01），小写字母表示差异显著（P＜0.05）。

2 结果

2.1 三聚氰胺对吉富罗非鱼生长的影响(见图1)

图1 三聚氰胺对吉富罗非鱼增重率的影响

由图1可知，从第7 d开始,随着三聚氰胺添加剂量的增加，试验组吉富罗非鱼的增重率呈降低趋势。在第21 d和第28 d，10000 mg/kg组罗非鱼的增重率显著低于对照组（P＜0.05），其余三个试验组吉富罗非鱼的增重率与对照组比较无显著差异（P＞0.05）。

2.2 三聚氰胺对吉富罗非鱼血清LSZ活力的影响(见图2)

图2 三聚氰胺对吉富罗非鱼血清LSZ活力的影响

由图2可知，三聚氰胺对吉富罗非鱼血清中溶菌酶活力无显著影响（P＞0.05）。

2.3 三聚氰胺对吉富罗非鱼血清SOD活力的影响(见图3)

由图3可知，三聚氰胺对吉富罗非鱼血清中的SOD活力无显著影响（P＞0.05）。

图3 三聚氰胺对吉富罗非鱼血清SOD活力的影响

2.4 三聚氰胺对吉富罗非鱼血清AKP活力的影响(见图4)

图4 三聚氰胺对吉富罗非鱼血清AKP活力的影响

由图4可知，三聚氰胺对吉富罗非鱼血清中的AKP活力的影响呈先升高后降低趋势,在第7 d和14 d，各试验组吉富罗非鱼血清中的AKP活力较对照组有所提高，但影响不显著（P＞0.05）；在第 21 d 和 28 d，各试验组罗非鱼血清中的AKP活力低于同期对照组，5000 mg/kg组和10000 mg/kg组显著低于同期对照组(P＜0.05)。

2.5 三聚氰胺对吉富罗非鱼肌肉组织中残留量的影响(见图5)

本试验中对照组吉富罗非鱼肌肉在整个试验阶段均未检测到三聚氰胺残留量；从第7 d开始，各试验组吉富罗非鱼肌肉中均检测到三聚氰胺残留。500 mg/kg组，吉富罗非鱼肌肉中的三聚氰胺残留量随着养殖时间的延长而逐渐升高；2000 mg/kg组和 5000 mg/kg组在第14 d就检测到较高的残留量，并且与第21 d、28d检测到的残留水平差不多；10000mg/kg组吉富罗非鱼肌肉中的三聚氰胺的残留量在第7 d就明显高于其他试验组，之后随养殖时间延长，三聚氰胺的残留量略有升高。

图5 饲料中三聚氰胺对吉富罗非鱼肌肉三聚氰胺残留的影响

3 讨论

3.1 三聚氰胺对吉富罗非鱼增重率的影响

目前,已有研究表明养殖动物长期摄食含三聚氰胺的饲料会对生长性能产生不良影响。张小燕等[4]（2009）在基础日粮中添加不同水平的三聚氰胺，喂养黄羽肉鸡42 d。结果表明，在基础日粮中添加三聚氰胺可显著降低黄羽肉鸡的平均体重(P＜0.05)。李倜等[5](2010)在肉鸡饲粮中添加 0(对照组)、250、500、1000 和2000 mg/kg三聚氰胺，喂养肉鸡42 d，结果表明，添加量为1000和2000 mg/kg时，肉鸡的平均体增重有下降的趋势。高春起等[6](2010)报道，日粮添加三聚氰胺对蛋鸭采食量和饲料转化率无显著影响(P＞0.05），随着日粮三聚氰胺含量的增加，平均蛋重和产蛋率呈逐渐降低的趋势。田永刚[7](2010)给小鼠灌胃四种浓度的三聚氰胺（0、1、2 和 4 mg/kg），染毒一周后，2 mg/kg浓度组小鼠体重增长显著性下降（P＜0.05），4 mg/kg浓度组小鼠体重极显著下降(P＜0.01)。刘海燕等[8]（2009）报道，饲料中添加三聚氰胺显著影响了花鲈21 d的摄食与生长(P＜0.05),最高剂量组(10000 mg/kg)花鲈的摄食率显著低于对照组(P＜0.05),而末均重和特定生长率显著低于0、500 mg/kg及 2000 mg/kg处理组(P＜0.05)。本试验的结果表明：从21 d开始，10000 mg/kg组吉富罗非鱼的增重率显著低于对照组(P＜0.05)，这与上述学者的研究结果一致。

3.2 三聚氰胺对吉富罗非鱼血清非特异性免疫指标的影响

本试验研究发现，三聚氰胺对吉富罗非鱼血清中的溶菌酶活力、SOD活力无显著影响，但对AKP活力有影响。在第7 d和第14 d，各试验组的吉富罗非鱼血清中的AKP活力呈升高趋势，在第21 d和28 d，各试验组血清中的AKP活力呈下降趋势，且5000 mg/kg和10000 mg/kg组吉富罗非鱼血清中的AKP活力显著低于同期对照组（P＜0.05）。AKP是一种膜结合蛋白，在体内直接参与磷酸基团的转移和代谢生理过程，与维持体内适宜的钙磷比例有关，并在免疫反应中发挥作用，当肝细胞受损时，血清中的AKP活性升高。血清AKP活性的降低主要由重症慢性肾炎并伴有慢性肾衰或者营养不良等病症引起[9]。研究表明,动物长期摄入过量的三聚氰胺,会对肝脏细胞和肾脏造成不同程度的损伤。Neerman等[10]（2004）给小鼠注射40 mg/kg剂量的三聚氰胺会造成肝坏死。张薇[11](2009)在SD大鼠急性试验中研究表明，光镜下可见少数肝细胞核出现固缩或沉积，局部可见炎性细胞浸润。刘汇涛[12](2010)用含三聚氰胺、三聚氰酸及二者混合物日粮饲喂蓝狐,在染毒第34、65和98 d血清碱性磷酸酶活性与对照相比差异不显著(P＞0.05)，但存在降低趋势,在染毒第126 d,Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组的血清碱性磷酸酶活性极显著降低(P＜0.01)。说明各添加三聚氰胺和三聚氰酸组蓝狐在第34 d肾脏可能已经开始受到损伤，但直到染毒第126 d才开始显现出来。此外，组织学研究表明，各添加三聚氰胺和三聚氰酸试验组蓝狐的肾脏受到了不同程度的损伤，肝脏也发生轻微病变。本试验的研究结果与上述学者的研究结果相似，在28 d的试验期内，各试验组吉富罗非鱼血清中的AKP活力在前两周呈升高趋势，后两周中AKP活力呈降低趋势(5000 mg/kg和10000 mg/kg组吉富罗非鱼的AKP活力显著低于对照组)，推测中、高剂量组吉富罗非鱼的肝细胞和肾脏可能在第14 d就开始有损伤，到第21 d开始显现出来。

3.3 三聚氰胺对吉富罗非鱼肌肉组织残留的影响

三聚氰胺的三嗪环结构比较稳定，在机体内的代谢属于不活泼代谢或惰性代谢。Mast等[13](1983)认为动物经口摄入三聚氰胺以后，在体内会发生水解，生成三聚氰胺同系物，再经过血液分布全身。Reimschuessel等[14](2008)在对斑点叉尾鮰进行三聚氰胺实验时发现，每日给一条斑点叉尾鮰400 mg/kg剂量的三聚氰胺3 d，休药1 d后其肌肉中三聚氰胺的残留量为210 mg/kg。燕磊等[15](2009)报道，当饲粮中添加不同剂量的三聚氰胺，肉鸭组织中三聚氰胺残留量随日粮中三聚氰胺含量的升高而线性升高。李倜[16](2010)在肉鸡饲料中添加不同剂量的三聚氰胺，饲喂23 d后，在肉鸡血浆、胸肌、肝脏、肾脏都有三聚氰胺残留，且残留量随着三聚氰胺添加量的增加而呈线性增加(P＜0.01)。刘海燕等[17](2010)报道，在花鲈饲料中添加不同剂量的三聚氰胺进行56 d的喂养实验，花鲈的肝脏和肌肉中均检测到了三聚氰胺的残留，在三聚氰胺日摄入量为每千克体重148.83 mg时,肝脏三聚氰胺残留量达到57.9 mg/kg，肌肉中三聚氰胺的残留量在三聚氰胺日摄入量为每千克体重80.34 mg和148.83 mg时分别为47.63 mg/kg和73.17mg/kg。本试验的研究结果与上述学者的研究结果相一致，从第7 d开始，各试验组吉富罗非鱼肌肉中均检测到三聚氰胺残留量。500 mg/kg剂量组吉富罗非鱼肌肉中的三聚氰胺残留量随着养殖时间的延长而逐渐升高，2000 mg/kg和5000 mg/kg剂量组在第14 d检测到较高的残留量，10000 mg/kg剂量组吉富罗非鱼肌肉中的三聚氰胺的残留量在第7 d就明显高于其他试验组。说明三聚氰胺在吉富罗非鱼肌肉中的残留量呈剂量依赖性，低剂量组还与投喂时间成正相关关系。

[1]刘海燕,张伟,薛敏,等.三聚氰胺对吉富罗非鱼的急性毒性研究[J].河北师范大学学报(自然科学版),2009,33(5):559-665.

[2]Hultmark D.Insect immunity:Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophera cecropia[J].Eur J Biochem.,1980,106:7-16.

[3]刘永涛,杨红,艾晓辉.高效液相色谱法检测水产品中三聚氰胺的残留量[J].分析实验室,2009,28:138-141.

[4]张小燕，施祖灏，陆俊贤,等.三聚氰胺对黄羽肉鸡生长性能和血液生化指标的影响[J].中国家畜,2009,31(21):25-28.

[5]李倜,丁雪梅,张克英,等.饲粮中添加三聚氰胺对肉鸡生长性能和健康的影响[J].动物营养学报,2010,22(6):1694-1702.

[6]高春起,武书庚,齐广海,等.三聚氰胺对蛋鸭产蛋性能、血清指标和肝肾组织结构的影响[J].中国农业科学,2010,43(5):1050-1056.

[7]田永刚.食品中低剂量三聚氰胺对雄性小鼠生长及生殖的影响[D].苏州大学硕士学位论文,2010.

[8]刘海燕，张伟，薛敏,等.三聚氰胺对花鲈的急性毒性研究[J].水生生物学报,2009,33(2):157-163.

[9]朱一堂,李福坤,孙艳,等.成年男性血清碱性磷酸酶活力降低的主要临床意义[J].河北北方学院学报(医学版)，2006，23(4)：59-60.

[10]Neerman M F,Zhang Wen,Parrish A R,et al.In vitro and in vivo evaluation of a melamine dendrimer as a vehicle for drug delivery[J].International Journal of Pharmaceutics,2004,28(1):129-132.

[11]张薇.三聚氰胺尿结石模型及中药三金汤干预作用研究[D].广西中医药大学硕士学位论文，2009.

[12]刘汇涛.三聚氰胺对蓝弧生产性能、血清指标及肝肾组织结构的影响[D].北京:中国农业科学院硕士学位论文,2010.

[13]Mast R W,Jefcoat A R,Sadler B M,et al.Metabolism,Disposition and Excretion of Melamine in Male Fisher 344 Rats[J].Food and Chemical Toxicology,1983,21(6):807-810.

[14]Reimschuessel R,Gieseker C M,Miller R A,et al.Evaluation of the renal effects of experimental feeding of melamine and cyanuric acid to fish and pigs[J].American Journal Veterinary Research,2008,69:1217-1228.

[15]燕磊,郭吉原,孙作为,等.饲喂不同含量三聚氰胺日粮后肉鸭组织中三聚氰胺的残留量分析[J].中国家禽,2009,31(13):16-19.

[16]李倜.三聚氰胺对肉鸡生产性能、健康的影响和组织残留、消除规律的研究[D].四川农业大学硕士学位论文,2010.

[17]刘海燕，张伟，薛敏,等.饲料中三聚氰胺对花鲈生长、生理机能及组织残留的影响[J].水生生物学报,2010,34(6):1097-1105.