成人白血病中PTPRO基因表达的研究

宋晓宁 杨琳 刘小军 温树鹏 罗建民

受体型蛋白酪氨酸磷酸酶-O(PTPRO)是PTP家族的成员之一。PTPRO在鼠、人类等脊椎动物中是高度保守的。PTPRO作为一个重要的酪氨酸磷酸酶，是一个候选的肿瘤抑制基因，具有重要的生理功能，并具有肿瘤抑制因子的大部分特征，在多种肿瘤组织中被高度甲基化，但是对PTPRO的研究还处在起步阶段。本研究将应用实时定量PCR(real-time PCR)的方法检测PTPRO基因在急性、慢性白血病发病时、缓解后、复发时及正常人的表达情况，初步探讨其在白血病发病中的作用，为分子靶向治疗及评价预后提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择河北医科大学第二医院和河北医科大学第三医院血液科2008年8月至2009年10月成人急性白血病(AL)患者80例，慢性粒细胞白血病(CML)患者15例，同期选择10例健康志愿者作为正常对照。均根据临床特征、血常规、骨髓细胞形态学、组织化学、免疫表型、融合基因、染色体等检查确诊，符合国内白血病诊断、分型标准。其中AL患者，男46例，女34例;年龄2～72岁，中位年龄32.0岁。CML患者，男9例，女6例;年龄20～65岁，中位年龄42.0岁。健康志愿者，男6例，女4例;年龄12～65岁，中位年龄38.1岁。将研究对象分为初治组52例［急性髓细胞白血病(AML)36例，急性淋巴细胞白血病(ALL)16例］，完全缓解组(CR组)28例，CML组15例，正常对照组(NC组)10例。按PTPRO基因表达水平中位值分为高表达组和低表达组。

1.2 方法

1.2.1 治疗方案:对于初治AML患者采用标准DA化疗方案(阿糖胞苷、柔红霉素)诱导缓解。AML患者采用全反式维甲酸(ATRA)或ATRA与三氧化二砷(As2O3)合用或以ATRA为主，联合应用小剂量DA(阿糖胞苷、柔红霉素)、HA(阿糖胞苷、高三尖杉酯碱)方案诱导分化治疗。对于ALL患者选用化疗方案VDLP(长春新碱、柔红霉素、强的松、左旋门冬酰氨酶)。对于CML患者应用羟基脲和小剂量化疗加干扰素治疗。疗效判定参照《血液病诊断及疗效标准》［1］。

1.2.2 骨髓单个核细胞(MNC)的分离:所有AL患者于治疗前均采集新鲜骨髓液4 ml以100 U/ml的肝素抗凝(肝素:骨髓液=1∶4)。用淋巴细胞分离液分离出MNC备用。

1.2.3 cDNA 合成:取 MNC(1×106)细胞用 Trizol试剂盒(Invitrogen公司)提取细胞总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性，并用分光光度仪测定RNA浓度。M-MLV逆转录酶、核糖核酸酶抑制剂(RNasin)、dNTP、Random Primer均购自美国Promega 公司。逆转录反应体系如下:5 × R.T.buffer 5 μl，Dntp 2.5 μl，Rnasin 2 μl，M-MLV 6 μl，Random Primer 1 μl，RNA 5 μg，用 DEPC 水补至 25 μl;反应条件为:42℃ 50 min，95℃5 min。

1.2.4 目的基因引物的合成:以GAPDH为内参照基因，引物由上海生物工程公司合成。见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.5 Syber Green I荧光定量PCR PCR反应液组成:Primer各1 μl，R.T.product 1 μl，2 × Master Mix 10 μl，双蒸水补足至反应终体积20 μl。反应条件如下:96℃ 4 min，然后3步反应:94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，进行 40 个循环，于每个循环的第3步72℃ 30 s收集荧光信号。扩增完毕后，进入结果分析界面，以GAPDH为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值(RQ值)，将RQ值用于统计分析。

1.3 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，常规进行方差齐性检验、正态性检验，多组间比较采用单因素方差分析，两组间的比较采用独立样本t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组中PTPRO mRNA的表达水平的比较 初治组低于CR 组(P=0.028)，CR组低于NC 组(P ＜0.01)，AML与ALL表达水平差异无统计学意义(P=0.158);CML组低于NC组(P=0.000 ＜0.01)和 CR 组(P=0.01)，与初治组差异无统计学意义(P=0.295)。PTPRO mRNA表达水平与年龄、性别均无关(P ＞0.05)。见表2。

表2 白血病患者及正常对照PTPRO基因表达水平

表2 白血病患者及正常对照PTPRO基因表达水平

组别PTPRO mRNA P 值AL 初治组(n=52) 0.7712 ±0.3190 0.000*CR 组(n=28) 1.073 ±0.0978 0.028#CML 组(n=15) 0.6315 ±0.3700 0.295#NC 组(n=10) 1.6497 ±0.5318 0.000#

2.2 基因表达水平高低与AL患者临床疗效的关系 52例初治AL中无早期死亡病例，按照标准化疗方案治疗后达CR的患者有36例。PTPRO基因表达水平中位值为:0.771。根据中位值分为高表达组和低表达组，2组CR率差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表3。

3 讨论

PTPRO是PTP家族的成员之一，第一次发现于1994年，Thomas等［2］以家兔为模型寻找肾小球特异的蛋白时发现PTPRO，当时命名为肾小球上皮蛋白1，即GLEPP1。PTPRO是一类组织特异性表达的基因，主要表达于肾和脑［3］，高敏感的RT-PCR发现该基因几乎存在与所有组织。PTPRO可能对人类肿瘤具有潜在的生长抑制能力，但要肯定它是一个真正的肿瘤抑制因子还需要更多的实验资料来论证。人们发现PTPRO具有肿瘤抑制因子的大部分特征，在多种肿瘤组织中被高度甲基化。已经证明PTPRO在肝癌、肺癌、结肠癌、慢性淋巴白血病中发现被甲基化而沉默［4－7］。PTPRO的表达水平变化还可能与乳腺癌的早期发生有相关性［8］。但是，目前对PTPRO基因在白血病中的研究处于起步阶段。本实验中PTPRO在AL患者初治组表达水平低于正常对照组，而缓解组患者表达水平升高。CML组PTPRO表达水平也明显低于NC组。提示AL及CML的发生可能与PTPRO的表达下降有关。化疗缓解后PTPRO基因水平升高仍未达到正常对照水平，提示AL的发病为多种因素、多个基因共同作用的结果。研究同时还进行了PTPRO基因表达水平高低与临床疗效的关系的比较。对52例初治AL患者根据中位值分为PTPRO高表达组与PTPRO低表达组，比较2组的首疗程缓解率，差别均无统计学意义，但这有待扩大样本例数进一步研究证实。总之，在AL的发病中存在PTPRO基因表达异常，为寻找AL发生、发展的特异性分子标志物、治疗靶点、预后评估提供依据。

表3 PTPRO基因高表达组与低表达组缓解率比较 例

1 张之南主编.血液病诊断及疗效标准.第3版.北京:科学出版社.2008.

2 Thomas PE，Wharram BL，Goyal M，et al.GLEPP1，a renal glomerular epithelial cell(podocyte)membrane protein-tyrosine phosphatase.Identification，molecular cloning，and characterization in rabbit.J Biol Chem，1994，269:19953-19962.

3 Kotani T，Murata Y，Ohnishi H，et al.Expression of PTPRO in the interneurons of adult mouse olfactory bulb.J Comp Neurol，2001，518:119-136.

4 Motiwala T，Ghoshal K，Das A，et al.Suppression of the protein tyrosine phosphatase receptor type O gene(PTPRO)by methylation in hepatocellular carcinomas.Oncogene，2003，22:6319-6331.

5 Motiwala T，Kutay H，Ghoshal K，et al.Protein tyrosine phosphatase receptor-type O(PTPRO)exhibits characteristics of a candidate tumor suppressor in human lung cancer.Proc Natl Acad Sci，2004，13844-13849.

6 Mori Y，Yin J，Sato F，et al.Identification of genes uniquely involved in frequent microsatellite instability colon carcinogenesis by expression profiling combined with epigenetic scanning.Cancer Res，2004，64:2434-2438.

7 Motiwala T，Majumder S，Kutay H，et al.Methylation and silencing of protein tyrosine phosphatase receptor type O in chronic lymphocytic leukemia.Clin Cancer Res，2007，13:3174-3181.

8 Ramaswamy B，Majumder S，Roy S，et al.Estrogen-mediated suppression of the gene encoding protein tyrosine phosphatase PTPRO in human breast cancer:mechanism and role in tamoxifen sensitivity.Mol Endocrinol，2009，23:176-187.