海马内注射MK-801对甲醛炎性痛大鼠海马NO含量的影响

刘凌云 李 欣 李 雯

（上海市杨浦区中心医院神经内科，上海 200090）

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一种具有独特理化性质和生物学活性的信息和效应分子，兼有信使物质和神经递质的功能，在神经系统参与多种生理及病理过程的整合[1]。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）阳性神经元广泛分布在中枢神经系统包括海马在内的脑区与核团。以往研究证实大鼠足底注射甲醛溶液后，除引起舔、咬注射侧脚掌等疼痛反应外，还导致大鼠海马NOS表达增加，NO产生增多[2]。小鼠侧脑室内注射NOS抑制剂L-NAME能够明显减轻甲醛诱导的疼痛反应，进一步证实NO在中枢神经系统疼痛整合过程中的重要作用[3]。但是，NO生成增加的机制尚未完全阐明。

大量研究证实，外周应用兴奋性氨基酸神经递质可导致机械痛觉过敏和自发痛，鞘内注射兴奋性氨基酸神经递质可诱发自主伤害性行为和痛觉过敏，兴奋性氨基酸神经递质通过作用于脊髓后角神经元N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体将伤害性信息传递致中枢神经系统，NMDA受体参与脊髓水平伤害性传入信息整合处理[4]。但是，在海马水平NOS表达增加，NO产生增多是否和NMDA受体活动有关，尚未见相关报道。因此，本研究通过观察海马内注射NMDA受体拮抗剂MK-801对甲醛炎性痛过程中海马NO含量变化情况，以深入探讨其内在机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

一氧化氮试剂盒购自南京建成生物工程公司。还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸、氯化硝基四氮唑蓝、MK-801均购自美国sigma公司。

1.2 疼痛动物模型构建

大鼠右侧后掌底面皮下注射5%甲醛溶液0.2mL构建疼痛模型。

1.3 实验动物

选用健康雄性SD大鼠28只，由河北医科大学实验动物中心提供，体质量260～280g。

1.4 实验分组

①甲醛组（F）：于大鼠右后掌皮下注射5%甲醛溶液0.2mL，注射甲醛溶液12h后，断头开颅取脑，分离双侧海马，液氮冻存；②甲醛+MK-801组（F+MK-801）：预先于大鼠双侧海马内各注射2μL MK-801（20nmol）溶液，15min后右后掌皮下注射5%甲醛溶液0.2mL，于注射甲醛溶液12h后，断头开颅取脑，分离双侧海马，液氮冻存。③甲醛+生理盐水组（F+NS）：预先与大鼠双侧海马内各注射2μLNS，15min后右后掌皮下注射5%甲醛溶液0.2mL，于注射甲醛溶液12h后，断头开颅取脑，分离双侧海马，液氮冻存；④对照组（Control）：不加任何处理，直接断头开颅取脑，分离双侧海马，液氮冻存。

1.5 双侧海马置管及注射法[5]

大鼠以10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉后，江湾Ⅰ型C立体定位仪固定头部，剪开头皮，暴露头骨，依据George Paxions& Charles Watson大鼠脑立体定位图谱，于双侧海马（A：3.0，LR：1.8，H：3.0）分别埋置不锈钢套管，以牙科水泥固定于颅骨上。术后应用抗生素3d预防感染，分笼单独饲养1周后用于实验。实验时甲醛+MK-801组采用微量注射器缓慢（0.5μL/min）注射2μL MK-801（20nmol），留针5min后慢慢退出。甲醛+生理盐水组相同部位注射等体积生理盐水。实验结束后注入滂天蓝（20g/L）核对注射部位。

1.6 海马中NO含量的测定

采用硝酸还原酶法进行NO含量测定。蛋白定量用考马斯亮兰法。实验操作按照试剂盒说明进行。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 大鼠痛反应

足底注射甲醛溶液大鼠即出现早期的疼痛反应，如舔、摇动足掌，后掌抬离盒底面等行为学改变。

2.2 海马内注射MK-801对海马NO含量的影响

甲醛组与甲醛+生理盐水组海马NO含量与对照组比较均明显升高（P＜0.01），甲醛组与甲醛+生理盐水组海马NO含量比较二者之间无显著差异。与甲醛组相比，甲醛+MK-801组海马组织NO含量明显降低（P＜0.01）。同组的左右两侧海马NO含量比较无显着性差异（Tab.1）。

Tab.1 Changes in NO content of hippocampus after right hind paw injection of formalin（±s, n=7）

Tab.1 Changes in NO content of hippocampus after right hind paw injection of formalin（±s, n=7）

*P＜0.05 vs control group, ＃P＜0.05 vs formalin group

Group NO content of hippocampus （μmol/g prot）Left Right Control 8.10±0.37 7.91±0.39 F 12.16±0.62* 12.22±0.70*F+NS 12.27±0.43* 12.48±0.71*F+MK-801 9.06±0.46＃ 8.75±0.61＃

3 讨 论

有研究报道，急性束缚与制动应激可以引起大鼠海马兴奋性氨基酸谷氨酸含量增加[6]，强迫游泳应激可诱导海马内NOS表达增加及NO含量明显升高[7]。因此，本研究认为足底注射甲醛溶液引起的组织损伤可引起剧烈疼痛，炎性疼痛也可作为一种刺激引起机体的应激反应，通过多种上行神经传导通路，将伤害性信息传入到海马，引起海马内多种神经递质大量释放，作用于海马神经元上的相应受体，激活神经元内一系列信号传导途径，引起NO产生的增多。

兴奋性氨基酸是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质，主要包括谷氨酸及天门冬氨酸，其通过与相应的受体结合参与中枢神经系统的信息传递。NMDA受体是一种重要的兴奋性氨基酸受体，广泛分布与脊髓背角神经元。大鼠鞘内注射谷氨酸或天门冬氨酸可诱发疼痛行为反应[8]；鞘内注射NMDA受体拮抗剂可抑制由结扎坐骨神经、皮下注射角叉菜胶所引起的疼痛反应[9]。这说明在脊髓水平，NMDA受体的激活在疼痛信息整合过程中发挥重要作用，而在海马水平NMDA受体的活动是否参与疼痛信息处理尚无明确定论。本研究发现，海马内注射MK-801阻断NMDA受体的活动后，与甲醛12h组相比，MK-801组海马NO含量明显降低。以上结果提示，甲醛炎症性疼痛过程中，海马组织NO代谢产物含量的增加可能与NMDA受体的活动有关。并且国外已有研究证实，海马齿状回内注射竞争性NMDA受体拮抗剂可以产生镇痛效应，显著减轻甲醛引起的疼痛反应，支持本实验结果[10]。

总之，本研究认为，NMDA受体参与了疼痛过程中海马NO生成增加，NMDA受体与疼痛信息整合密切相关，采取措施阻断兴奋性氨基酸受体有望减轻疼痛，为开发有效、安全的临床新药提供了实验基础。

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