牛跟腱制造海绵状胶原蛋白纤维的技术研究

王秋卓

随着生物工程技术的迅猛发展和重大突破，生物材料己成为各国学者竞相进行研究和开发的热点。其中胶原止血海绵因具有可吸收性、良好的生物相容性、较低的免疫原性、较好的稳定性和机械强度等优点而受到普遍青睐[1]。20 世纪 80年代，即已在美国和欧洲广泛上市并应用于临床，并取得了很好的临床效果，目前广泛应用于神经外科手术止血、肝脾脏创伤止血、肾脏手术止血、胃溃疡岀血、牙科手术止血、泌尿外科手术止血及皮肤创伤等多个领域[2]。但目前胶原止血材料大多因生产成本较高或纯度较差等缺点，止血效果不够理想，远远无法满足实际临床需要。

为此，我们以牛跟腱为原材料，针对胶原止血材料均匀度、抗原性、色泽以及纤维细度等性状，在现有技术的基础上，进一步深入研究了可吸收性胶原止血海绵的关键生产步骤并进行改造，并观察了产品的纯度和胶原纤维结构。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜牛跟腱；常规试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 胶原蛋白纤维的制备[3-5]

1.2.1.1 预处理 将新鲜牛跟腱洗净，置于超净工作台上的洁净不锈钢盘中，剔除黏膜、脂肪等附着组织，75%乙醇除菌、除脂后，–20℃速冻保存。取速冻后牛跟腱，用切片机切成 1mm 薄片，称取 10 g 牛跟腱，加入 200 ml去离子水，4℃恒温条件下用切碎机打碎、匀浆，每次匀浆时间为30min，直至组织悬浮不见组织碎片为止，置于冰柜 4℃冷却。

1.2.1.2 提纯酶化 在冷却后的组织悬浮溶液中分别加入 5 mol/L NaCl 溶液 50 ml、HAc 溶液 7.5 ml，以及10 mg/ml 胃蛋白酶溶液 2.5 ml，调整 NaCl、HAc、胃蛋白酶的最终浓度分别为1 mol/L、0.5 mol/L、0.1 mg/ml，4℃消化 48 h，以利用胃蛋白酶消化去除非胶原蛋白和胶原蛋白的非螺旋部分。

1.2.1.3 成纤维 将提纯酶化后样品 3000×g离心30min，去除上清液（包括蛋白多肽和其他组织细胞成分）。在沉淀中加入 300 ml 去离子水，匀浆，以 1 mol/L NaOH调节溶液的 pH 值为7.0 左右，4℃放置过夜。3000×g离心 30min，去除上清液（包括微量的残留胃蛋白酶和DNA）。在沉淀中加入 10mmol/L HCl 溶液 300 ml，摇荡后 4℃放置过夜。匀浆，加入 1/10 体积的 0.2 mol/L Na2HPO4调节溶液的 pH 值为7.2，4℃放置过夜。3000×g离心 30min，去除上清液，以去离子水洗涤沉淀后，加入 200 ml 去离子水，充分匀浆，置于模具中，–50℃速冻，然后在冷冻干燥机中冻干 28 h，冻干曲线为–45～–5℃20 h、–5～0℃4 h、0～20℃4 h，20℃保温 4 h。

实验均在符合 GMP 标准的实验室中进行，环境洁净度控制在 1 万级，操作温度在 4～8℃范围内。

1.2.2 胶原蛋白纤维纯度分析 采用 SDS-PAGE 法。将1 mg 样品溶于 5 ml SDS-PAGE 样品溶液，95℃水浴振荡加热 5min。以 I 型胶原标准品作为对照，上样，4%凝胶和 8%分离胶分离后，考马斯亮蓝染色。

1.2.3 胶原蛋白纤维结构分析 利用透射电镜和衍射实验，观察胶原纤维的完整性。电镜下可见一定周期性横纹的纹路是鉴定胶原纤维的决定性依据。

将样品用 PBS 稀释至终浓度为0.1 mg/ml，并充分振荡使之分散成单纤维，然后转至电镜载网（碳化镀膜）上，放置 10min。在水中漂洗 2～3 次，加醋酸铀染色 5～10min，在水中漂洗 5～10min，置于电镜下观察。

2 结果

2.1 外观性状

图1 胶原蛋白纤维 SDS-PAGE 分析

制备的样品洁白、疏松、均匀，类似于去脂棉性状的胶原蛋白纤维，根据模具不同可制成海绵状或片状等不同形状。

2.2 胶原蛋白纤维纯度分析

SDS-PAGE 电泳分析结果显示，在 I 型胶原标准品电泳带相对应处可见单一、清晰的胶原蛋白纤维条带，样品纯度较高（图1）。

2.3 胶原蛋白纤维结构分析

电镜下观察胶原蛋白纤维结构，可见胶原纤维特有的一定周期性横纹纹路，结构完整（图2）。

图2 胶原蛋白纤维结构的电镜观察（×200 000）

3 讨论

本技术在现有胶原蛋白纤维生产技术的基础上加以改造，克服了酶化学法提纯重组胶原分子生产工艺复杂、成本高、胶原纤维稳定性和机械强度较差的缺点，同时也克服了化学法制备胶原纤维的纯度较差且无法去除胶原分子的非螺旋部分，导致免疫原性较强的不足[6-8]。在北京、成都、内蒙等地进行的重复性实验表明，本技术具有良好的重复性和再现性，制造的产品也比较理想。

我们利用天然胶原蛋白纤维良好的止血功能及可靠的纤维机械强度，利用胃蛋白酶消化，有效去除了非胶原蛋白和胶原蛋白的非螺旋结构 C 末端和 N 末端，从而消除了材料原有的抗原性；在此基础上，对样品又进行了两步纯化，进一步去除了蛋白多肽、其他组织细胞以及残留的胃蛋白酶[9-10]。经过特殊工艺进行结构修饰后，实验结果表明所得的胶原蛋白纤维材料具有低抗原性，以及良好的生物相容性、稳定性和机械强度，是一种理想的止血生物材料。

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