黄芪多糖对斑马鱼生长发育及衰老的影响

夏广清，韩晓娟

(1.通化师范学院 生物系，吉林 通化 134002；2.东北师范大学，吉林 长春 130000)

黄芪抗衰老作用的研究以体内实验和血清药理学方法为常见[1-2].黄芪多糖(astragalin polyose APS)为黄芪的主要成分，大量药理及临床实验结果表明，APS具有抗衰老活性[3].本实验以斑马鱼为实验材料，观察了黄芪多糖不同浓度对其细胞分化及与细胞信号转导通路关键基因表达的影响，为黄芪多糖抗衰老提供理论依据.

1 材料与方法

材料：野生型斑马鱼由中国海洋大学生命科学院提供，在处理的前一天，将雌雄斑马鱼雌雄进行分离，并与第二天上午进行交配后收集鱼卵，并在28℃条件下培养，取孵育8小时发育正常的斑马鱼幼胚置于24微孔板中，每一微孔板15只斑马鱼幼胚，设置三次重复，每一处理分别设置空白对照组、黄芪多糖低(0.125mg/ml)、中(0.25mg/ml)、高(0.5mg/ml)浓度进行处理，每一天更换一次培养液，连续处理三天，搜集样品，进行染色及基因表达分析.

药物及试剂:黄芪多糖纯样品购自陕西昂盛生物医药科技有限公司，β-半乳糖苷酶及吖啶购自Sigma公司.将10mg黄芪多糖溶于1ml孵育鱼卵用的水溶液中(egg water)，制成10mg/ml储存液，4℃保存.

样品的采集与处理:取孵育8个小时发育正常的斑马鱼进行药物处理，每一处理浓度30个样品，三次重复，连续处理三天，光学显微镜下观察鱼的生长发育状态.

样品的SA-β-gal染色分析:取连续处理三天发育正常的斑马鱼样品，PBS洗3～5次，4%paraformal-dehyde(PFA)4℃固定1～3天；PBS洗3～4次后PBS保存1～3天；然后PBS洗1次，加入染色液(25ul/ml)37℃培养16～24小时观察照相.

样品AO染色分析：取处理3天的样品，放置在含200ug/ml的AO的溶液中.30℃条件下培养30分钟，然后用孵育鱼卵水溶液洗8次，每次5分钟后，进行观察照相.

2 实验结果与分析

2.1黄芪多糖对斑马鱼生长发育的影响

给药处理24h后，统计了各处理对斑马鱼存活的影响，结果见图1.分析结果表明，黄芪多糖在0.125～0.25mg/ml对斑马鱼的发育影响不大，但当黄芪多糖浓度高于0.5mg/ml时，斑马鱼的生存受到影响，与对照相比达到0.01显著水平.此外，高浓度的黄芪多糖除引起斑马鱼高的致死率外，对斑马鱼的发育也产生了明显的影响，在高黄芪多糖处理浓度下，斑马鱼表现为生长弯曲的畸形生长状态(见图2)，这也许是导致斑马鱼致死的主要原因.

图1 黄芪多糖不同浓度对斑马鱼存活的影响。 图2 (a)发育正常的斑马鱼，(b)生长畸形的斑马鱼

2.2黄芪多糖处理对斑马鱼衰老的影响

以往对黄芪抗衰老的作用实验表明，黄芪提取物能通过增加内生性的抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性，稳定细胞膜，从而减轻神经细胞损害，延缓细胞衰老.SA-β-Gal阳性率能较好地反应细胞群体或个体组织的老化速度，是反映衰老程度的重要生物学指标，被广泛应用.黄芪多糖不同浓度处理斑马鱼的SA-β-Gal染色结果表明(图3)，低浓度的黄芪多糖(0.125～0.25mg/ml)能有效干预斑马鱼胚胎发育细胞的衰老.然而在胚胎发育的早期的AO染色结果表明，各处理浓度对细胞早期的凋亡并没有显著影响(图4).

图3黄芪多糖处理对斑马鱼SA-β-Gal染色的影响(A SA-β-gal荧光统计分析图；B SA-β-gal荧光染色图a对照，b、c、d分别代表黄芪多糖浓度0.125mg/ml, 0.25mg/ml和0.5mg/ml)

图4黄芪多糖处理对斑马鱼AO染色的影响(A AAO染色荧光统计分析图；B AO荧光染色图a对照，b、 、c d分别代表黄芪多糖浓度0.125mg/ml, 0.25mg/ml和0.5mg/ml)

3 讨论

近年来延缓衰老以及老年病的预防已经成为国内外研究的焦点，寻找有效地抗衰老药物是衰老研究中的一个重要方面，由于化学药物的广泛使用及其毒副作用，研究的方向已瞩目与传统中药.黄芪是最常用的“扶正固本，补中益气”中药之一，研究表明黄芪提取物及其有效成分可以减少自由基的过氧化作用，增强抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性，稳定细胞膜，延缓细胞衰老.但以往的研究多集中在细胞水平上，在斑马鱼的研究上尚未见相关报道.斑马鱼繁殖能力强，适于大规模诱变育种，其体外受精和胚胎透明的特点使其便于观察，此外，斑马鱼从受精卵开始到120小时，细胞增殖、迁移、分化，最终形成各种器官、组织，并且开始行使相应的生理生化功能.这一阶段，是斑马鱼基因作用的最活跃阶段，也是斑马鱼胚胎发育过程中最重要阶段，因此，斑马鱼作为新型模式动物的优势正在逐渐被人们所认识，它在遗传学，发育生物学的研究中已被越来越广泛的应用[4].斑马鱼的神经中枢系统、内脏器官、血液以及视觉系统，在基因水平上87%与人类同源，早期发育与人类极为相似，已成为研究相关疾病基因的最佳模式生物.在国际上，斑马鱼模式生物的使用正逐渐拓展和深入生命体的多种系统(例如，神经系统、心血管系统、免疫系统等)的发育、功能和疾病(例如，神经退行性疾病、遗传性心血管疾病、糖尿病等)的研究中，并已用于小分子化合物的规模新药筛选.

本实验结果表明，黄芪多糖可以增强细胞活力，β-半乳糖苷酶活性下降，提示黄芪多糖在体内有很好的抗衰老作用.

参考文献：

[1]张鹏霞，朴金花，欧芹，等.黄芪对老年小鼠线粒体Mn-SOD，MDA及脑细胞凋亡影响的实验研究[J].中国老年学杂志，2003，23(9).

[2]李泓梅，等.黄芪血清药理对人胚肺二倍体成纤细胞(HDF)抗衰老作用机制的研究[J].中国老年学杂志，2005，25(12).

[3]赵莲芳，郑玉淑，朴慧顺，等.黄芪多糖及人参皂苷对衰老小鼠的抗衰老作用[J].延边大学医学学报，2006，12(29).

[4]郑丽丽，吴端生.斑马鱼实验动物化研究及应用[J].南华大学学报(医学版)，2008，36(2).