口服三苯双脒不同疗程抗小鼠旋毛虫成囊期幼虫的效果观察*

李润花,高晋华,裴彦江,李起超,申金雁,殷国荣

旋毛虫病(trichinosis)是由旋毛形线虫(Trichnella spiralis,简称旋毛虫)引起的一种严重的人兽共患寄生虫病。近年来,随着烧、烤、涮等饮食方式的流行,旋毛虫病发病率呈上升趋势[1]。旋毛虫成虫和幼虫分别寄生于同一宿主的小肠和肌肉内,成囊期幼虫(肌肉期幼虫)可在宿主体内存活数年,为主要致病虫期。多种抗肠道线虫药对肠道旋毛虫成虫有很强杀死作用,但杀死横纹肌内成囊期幼虫的效果较差,因而筛选抗成囊期幼虫的有效药物对于治疗本病至关重要。

三苯双脒(Tribendimidine,TBD)是中国食品与药品管理局2004年首次注册的抗肠道蠕虫药[2]。实验研究和临床试验证明,TBD对人蛔虫、钩虫和蛲虫感染的疗效较好,驱虫作用迅速,不良反应轻微,无致突变性和致畸性[2-3],尤其对美洲钩虫感染的疗效优于阿苯达唑[4-6]。

有关TBD抗旋毛虫的研究较少,尚无临床应用资料。张鸿满等研究表明,TBD对大鼠肠道旋毛虫成虫有较强的驱杀作用,但对移行期和成囊期幼虫的杀虫作用不及阿苯达唑[7]。薛剑等实验表明TBD对小鼠旋毛虫成虫和移行期幼虫有较好的疗效,但对成囊期幼虫无效[8]。本课题组前期研究表明,口服大剂量TBD可有效杀死小鼠横纹肌中的成囊期幼虫[9]。本研究比较了以不同疗程口服大剂量TBD杀死小鼠肌肉中旋毛虫成囊期幼虫的效果,探讨治疗旋毛虫病囊包期可能性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 三苯双脒及配制 三苯双脒(Tribendimidine,TBD)购自山东新华制药股份有限公司,批号0908036。用7%吐温-80和 3%乙醇溶液配制30mg/ml的混悬液[7],用于灌胃给药。

1.1.2 实验动物及虫株 8周龄BALB/c小鼠80只(SPF级),体重20～24g,购自中国医学科学院实验动物研究所。旋毛形线虫(T.spiralis,T1),引自首都医科大学寄生虫学教研室,山西医科大学医学寄生虫学研究所接种小鼠保种。

1.2 方法

1.2.1 动物感染与治疗 8周龄BALB/c小鼠40只,随机均分为5组,每只小鼠口饲感染旋毛虫成囊期幼虫50条。感染后第29d,分别以不同疗程(连续给药2、4、6、8 d)口服三苯双脒300mg/(kg·d),对照组不治疗。记录小鼠健康状况。停药后第7d,颈椎脱臼处死小鼠。肌肉压片法观察膈肌、咬肌、胸肌、腓肠肌中成囊期幼虫存活情况并计数。

1.2.2 疗效观察 停药后第7 d,颈椎脱臼处死小鼠。分别取每只小鼠膈肌、咬肌、胸肌、腓肠肌约0.1g,准确称重后,肌肉压片法检查成囊期幼虫。光学显微镜观察(×100),计算每克肌肉中成囊期幼虫数、存活虫数、死亡虫数、计算减虫率和死虫率。每克肌肉幼虫数=镜检虫数÷肌肉重量(克);减虫率=[(对照组平均虫数-治疗组平均虫数)÷对照组平均虫数]×100%;死虫率=死亡虫数÷总虫数×100%。为验证疗效,另取40只8周龄BALB/c小鼠,随机均分为5组,分别用不同疗程治疗后的小鼠膈肌成囊期幼虫50条/只口饲感染,感染后第29d,肌肉压片法计数膈肌中成囊期幼虫。

1.2.3 成囊期幼虫存活状况的判断 光学显微镜观察(×100)每个成囊期幼虫的存活状况,并分别计数。参照文献[9]中判断存活和死亡成囊期幼虫的标准,将死亡成囊期幼虫分为8类,即①囊包完整,幼虫无规则卷曲;②囊包完整,幼虫强直性伸展;③囊包完整,幼虫结构模糊;④囊包不完整,幼虫结构模糊;⑤囊包不完整,幼虫部分崩解;⑥囊包不完整,幼虫全部崩解;⑦囊包和(或)幼虫钙化;⑧囊包结构模糊,幼虫完全消失。

1.2.4 统计学分析 数据采用(±s)表示,使用SPSS11.5统计学软件处理。多个样本均数比较用方差分析及LSD-t检验,P＜0.05为显著性差异。

2 结 果

2.1 小鼠健康状况 实验期间,各组小鼠采食、饮水正常,健康状况良好,未见药物不良反应。

2.2 成囊期幼虫的虫荷及减虫率、死虫率 以每克肌肉检出幼虫数为观察指标,膈肌中成囊期幼虫总数最高,咬肌次之,胸肌和腓肠肌相近。随着TBD治疗次数(疗程)的增加,4个部位肌肉中成囊期幼虫总虫荷和活虫数均呈下降趋势,而死虫数呈上升趋势。与对照组相比,2 d疗程组及2 d以上疗程组膈肌、咬肌和腓肠肌中成囊期幼虫总虫数和存活虫数均显著减少(P＜0.05、P＜0.01),而胸肌中总虫数仅在6 d疗程组和 8 d疗程组显著减少(P＜0.05、P＜0.01)。随着治疗次数(疗程)的增加,膈肌、咬肌、胸肌和腓肠肌的幼虫死亡率呈上升趋势,其中6 d疗程组分别为 96.16%、98.06、99.13%和98.56%(P＜0.01),8 d疗程组组膈肌为99.62%、其他3部位肌肉均为100%(P＜0.01)。见表1-表4。

表1 口服三苯双脒不同疗程抗小鼠膈肌旋毛虫成囊期幼虫的效果Table 1 Effect of tribendimidine oral administration on encapsulated larvae of Trichinella spiralis in diaphragmatic muscle in mice at different courses of treatment

表2 口服三苯双脒不同疗程抗小鼠咬肌旋毛虫成囊期幼虫的效果Table 2 Effect of tribendimidine oral administration on Trichinella spiralis encapsulated larvae in jugomaxillary muscle in mice at different courses of treatment

表3 口服三苯双脒不同疗程抗小鼠胸肌旋毛虫成囊期幼虫的效果Table 3 Effect of tribendimidine oral administration t on encapsulated larvae of Trichinella spiralis in pectoral muscle in mice at different courses of treatmen

2.3 存活和死亡成囊期幼虫的特征 依据本研究判断存活和死亡成囊期幼虫的标准,将镜下所见成囊期幼虫逐个分类。现以膈肌为例,描述存活和死亡幼虫的形态特征。图1显示了存活和死亡成囊期幼虫的表现,对照组膈肌成囊期幼虫的密度最高,存活成囊期幼虫的结构清晰,囊包完整,幼虫自然卷曲,幼虫与囊包之间有明显的较透明区。随着疗程增加,膈肌成囊期幼虫的密度第次降低,存活幼虫减少,死亡幼虫增多。

2.4 疗效验证性感染结果 以不同疗程口服三苯双脒治疗后的小鼠膈肌成囊期幼虫感染小鼠的疗效验证性感染表明,对照组和2 d疗程组小鼠的感染率均为100%,但2 d疗程组的平均虫荷显著低于对照组(P＜0.01)。4 d及以上疗程组小鼠的感染率降低,其中6 d(37.5%)和8 d(12.5%)与对照组差异显著(P＜0.01)。2 d及以上疗程组小鼠平均虫荷和平均减虫率均显著低于对照组(P＜0.01),见表5。

表4 口服三苯双脒不同疗程抗小鼠腓肠肌旋毛虫成囊期幼虫的效果Table 4 Effect of tribendimidine oraladministration at different courses of treatment on encapsulated larvae of Trichinella spiralis in gastrocnemius muscle in mice

图1 口服三苯双脒不同疗程对小鼠膈肌中旋毛虫囊包幼虫的杀灭效果A.对照组(control group),B.2 d疗程(2 d course of treatment),C.4 d疗程(4 d course of treatment),D.6 d疗程(6 d course of treatment)L.存活囊包幼虫;1～8.死亡囊包幼虫。1.囊包完整,幼虫无规则卷曲;2.囊包完整,幼虫强直性伸展;3.囊包完整,幼虫结构模糊;4.囊包不完整,幼虫结构模糊;5.囊包不完整,幼虫部分崩解;6.囊包不完整,幼虫全部崩解;7.囊包和(或)幼虫呈黑色、钙化;8.囊包结构模糊,幼虫完全消失。Fig.1 Effect of tribendimidine given orally at different courses of treatment against Trichinellaspiralis encapsulated larvae in diaphragmatic muscle in miceL.Survival encapsulated larva;1-8.Dead encapsulated larvae.1.Capsule is complete,larva is random coil;2.Capsule is complete,larva is tonic extension;3.Capsule is complete,structure of larva is cloudiness;4.Capsule is incomplete,structure of larva is cloudiness;5.Capsule is incomplete,larva is partial disintegration;6.Capsule is incomplete,larva is whole disintegration;7.Capsule and/or larva changed black and was calcification;8.Structure of capsule is cloudiness,larva is whole disappearance.

表5 以三苯双脒治疗后小鼠的膈肌再次感染小鼠的膈肌成囊期幼虫数Table 5 Numbers of encapsulated larvae in diaphragmatic muscle in mice mice post-treatment with tribendimidine

3 讨 论

本研究观察了不同疗程口服TBD 300mg/(kg·d)治疗小鼠旋毛虫成囊期幼虫感染的效果,旨在确定一个合理疗程。结果表明,随着治疗次数的增加,膈肌、咬肌、胸肌和腓肠肌中成囊期幼虫总虫数和存活虫数呈趋势,而幼虫死亡率呈上升趋势,以6d和8 d疗程最为显著,表明TBD的抗成囊期幼虫效果具有疗程依赖性。任海南等研究表明,三苯双脒一次口服对小鼠的急性 LD50为 950±207mg/kg[10]。本研究所用TBD剂量为300mg/(kg·d),连续给药8 d未见不良反应。

许世锷等给十二指肠钩虫和美洲钩虫感染者顿服TBD 400mg,观察到对钩虫的体壁、肠管、睾丸及卵巢的超微结构均有明显的破坏作用,对卵巢的破坏最为严重[11]。Keiser等给感染麝猫后睾吸虫地鼠单剂口服TBD 400 mg/kg可使虫荷减少63.0%,扫描电镜术观察到TBD 10μ g/ml体外作用可致麝猫后睾吸虫(Opisthorchisviverrini)皮层损伤[12]。

我们前期研究将判断存活和死亡成囊期幼虫的标准为6类[9]。本研究进一步将死亡成囊期幼虫的分类细化分为8类,更加合理。结果表明被TBD杀死成囊期幼虫主要表现为虫体部分或完全崩解,并可见空囊包和有愈合、消失的倾向的空囊包。据此推断,成囊期幼虫的总虫荷降低的主要原因可能与幼虫完全崩解后的空囊包愈合、消失有关。

有关研究证实,TBD在胃肠道环境不稳定,迅速分解成对-(1-二甲氨基乙亚氨基)苯胺(简称氨脒,dADT)和对苯二甲醛,继而代谢生成的乙酰氨脒(AdADT)、对苯二甲酸等产物吸收、分布迅速。大部分药物在48h内以dADT和AdADT的形式尿液排泄[13-14]。Xiao等研究证实,TBD及其在体外有很强杀华支睾吸虫成虫作用,但AdADT的体外杀虫作用很弱。口服TBD、dADT和AdADT对大鼠感染华支睾吸虫有相似的疗效,大鼠肌肉中TBD和dADT也表现抗华支睾吸虫作用[15]。本研究观察到TBD有效杀死不同部位肌肉中旋毛虫成囊期幼虫,说明TBD的代谢产物dADT和AdADT可随血液循环到达全身肌肉。

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