禽流感(H5+H9)二价灭活疫苗对珍禽的免疫效果观察*

李兴玉,王 强,杨晓梅,牛李丽,谢 晶,余建秋,廖党金,余星明,林 毅,邓家波

禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒引起禽类(家禽和野禽)的一种危害严重的传染病。高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)可引起禽类大批发病死亡,也可引起人类感染死亡,世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病,我国也将高致病禽流感列为一类重大动物疫病。目前流行于中国大陆的禽流感病毒主要血清型是H5亚型和H9亚型,H5亚型禽流感病毒是主要的高致病性毒株,可引起禽类大批急性发病死亡;H9亚型禽流感病毒多为低致病性毒株,主要引起产蛋下降或呼吸道症状。近年来,禽流感在野生鸟类、动物园珍禽中也有暴发的情况[1-2],不仅加大了珍禽保护的难度,同时也对动物园的游客和工作人员健康造成了一定威胁。因此研究适用于珍禽禽流感的免疫技术不仅关系到珍禽保护工作,也关系到公共卫生安全。目前我国没有专门用于珍禽的禽流感疫苗,珍禽禽流感的防控只能使用家禽禽流感疫苗。但关于家禽禽流感疫苗用于珍禽的安全性及免疫效果国内外研究报道的较少,因此本实验对成都动物园的多种珍禽进行了家禽禽流感(H5+H9)二价灭活疫苗的免疫试验,并定期采血检测其血清中HI抗体效价,评价免疫效果,为制定珍禽的禽流感免疫技术提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验疫苗 禽流感(H5+H9)二价灭活疫苗,批号:2009008,哈尔滨维科生物技术开发公司生产。

1.1.2 试验动物 成都动物园圈养的15种珍禽(孔雀、原鸡、白鹇、七彩山鸡、蓝马鸡、白冠长尾雉、东方白鹳、丹顶鹤、秃鹫、绿头鸭、黑天鹅、斑头雁、黄鸭、鸳鸯、鹦鹉)。

1.1.3 检测试剂 禽流感H5亚型抗原、阳性血清(批号分别为 200901、200801);禽流感H9亚型抗原、阳性血清(批号分别为07102101、080305),均购自哈尔滨维科生物技术开发公司。

1.1.4 1%红细胞悬液 采集3只SPF公鸡血液与等体积阿氏液混合,用pH值7.2的0.01mo1/L PBS液离心洗涤3次,洗涤后用PBS液配成体积分数为1%红细胞悬液。

1.2 方法

1.2.1 免疫 用禽流感疫苗免疫成都动物园圈养的15种珍禽,根据品种、年龄的不同,分别于胸肌或颈部皮下注射0.3-1.0mL/羽,所有免疫珍禽都套上脚标,做好编号。

1.2.2 血清采集 分别在免疫前及免疫后14d、21d、35d、90d翅静脉采血,待血清析出后,8 000r/min离心4min,吸出血清并编号,-20℃冰箱保存备用。

1.2.3 抗体检测 参照《高致病性禽流感诊断技术》(GB/T 18936-2003)所规定的方法,分别用禽流感H5亚型和H9亚型HI标准抗原,进行免疫抗体水平检测。

1.2.4 结果判定 以完全抑制4个血凝单位抗原的血清最高稀释倍数作为HI效价,只有阴性对照孔效价不大于2 log2,阳性对照孔效价误差不超过1个log2时,试验结果才有效。参照农业部发布的农业行业标准《高致病性禽流感—免疫技术规范》,禽流感HI效价4 log2判为免疫合格。

2 结 果

2.1 用禽流感(H5+H9)二价灭活苗免疫动物园圈养的15种珍禽后,其饮水、采食及精神状态均正常。

2.2 15种珍禽群体H5亚型禽流感HI抗体平均水平在免疫前及免疫后14d、21d、35d、90d分别为1.92 log2、4.90 log2、7.21 log2、5.80 log2 和 5.02 log2;H5亚型抗体合格率在免疫前及免疫后14d、21d、35d、90d 分别为 25%、62.29%、91.67%、70.83%和70.83%,H5亚型禽流感抗体水平在21d达到高峰,35d时抗体水平已开始下降,其中七彩山鸡、丹顶鹤、黄鸭平均抗体水平已下降到4 log2以下。孔雀、原鸡、白鹇、斑头雁等产生抗体水平较好,而白冠长尾雉、黄鸭等产生抗体较差,鸳鸯始终没有检测出H5亚型抗体。结果详见表1。

2.3 15种珍禽群体H9亚型禽流感HI抗体水平在免疫前及免疫后14d、21d、35d、90d分别为2.06 log2、7.73 log2、7.65 log2、7.10 log2 和 6.38 log2,H9亚型抗体合格率在免疫前及免疫后14d、21d、35d、90d 分别为 29.17%、95.83%、95.83%、91.67%和85.42%,H9亚型抗体水平在免疫后14d达到高峰,到90d群体抗体水平均维持在6 log2以上。孔雀、原鸡、白鹇、斑头雁等产生抗体水平较高,而白冠长尾雉、鸳鸯、鹦鹉等产生抗体较差。结果详见表2。

表1 免疫珍禽H5亚型禽流感HI抗体检测结果

表2 免疫珍禽H9亚型禽流感HI抗体检测结果

3 讨论与分析

3.1 当前疫苗免疫仍然是禽流感防制的主要措施。国内目前没有专门用于珍禽的禽流感疫苗,珍禽禽流感防控是采用家禽疫苗,而家禽疫苗用于珍禽免疫的安全性和免疫效果国内仅有零星的研究报道,由于试验样本及试验条件的差异,各家得出的结论也不尽一致[3-8]。有些珍禽如东方白鹳、绿头鸭、白冠长尾雉等国内尚无研究报道。本次试验采用禽流感(H5+H9)二价灭活苗对动物园圈养的15种珍禽进行免疫,免疫试验期内,未出现免疫副反应,可见家禽禽流感疫苗用于珍禽免疫是安全的,这与梁少良、吴艳云等人的报道是一致[3,5]。

3.2 免疫的15种珍禽(除鸳鸯外)都能同时产生H5和H9亚型HI抗体。珍禽群体H5亚型HI抗体免疫后14d即可达到4.9 log2,免疫后21d达到高峰,为7.21 log2,孔雀、原鸡、白鹇、斑头雁等产生抗体水平较好,而白冠长尾雉、黄鸭等产生抗体较差,鸳鸯始终没有检测出H5亚型抗体;H9亚型HI抗体14d达高峰,为7.73 log2,之后能维持较长的时间,孔雀、原鸡、白鹇、斑头雁等产生抗体水平较高,而白冠长尾雉、鸳鸯、鹦鹉等产生抗体较差。试验结果比吴艳云、梁少良和姜北宇等人报道的免疫效果更好[3-5],这可能与免疫的珍禽的品种、免疫剂量以及免疫前动物群体的基础抗体水平有关。试验过程中还发现东方白鹳不同个体对禽流感(H5+H9)二价灭活苗的不同亚型抗原的免疫应答反应差别较大,免疫的三只东方白鹳中有两只产生了H5亚型禽流感HI抗体和H9亚型禽流感HI抗体,有一只却只产生了H9亚型禽流感HI抗体;两只鹦鹉也是对禽流感(H5+H9)二价灭活苗的不同亚型抗原的免疫应答反应差别很大,两只鹦鹉没有产生H5亚型禽流感HI抗体,却能产生较好的H9亚型禽流感HI抗体。出现上述现象的原因还有待进一步研究。

3.3 本次试验在国内首次应用禽流感(H5+H9)二价灭活疫苗对动物园圈养珍禽进行免疫试验研究,其中对东方白鹳、绿头鸭、白冠长尾雉的免疫研究在国内属首次报道,试验结果对制定国内动物园珍禽禽流感免疫技术具有重要的借鉴意义。

3.4 现已证实禽流感病毒广泛分布于世界范围内的许多家禽和多种鸟类,覆盖22科88种,其中主要有雁形目、鸻形目、雀形目中野鸟。各种野鸟尤其是野生水禽是禽流感病毒的主要储存宿主,所有16种HA亚型(除H13亚型病毒仅在海岸鸟和鸥类中发现)和9种NA亚型的病毒都可以在野生水禽中分离出[9-11]。动物园是各种鸟类聚集的地方,也是人类与珍禽接触的主要场所,各种鸟类的汇聚为禽流感病毒的基因重排及基因变异创造了有利环境,增加了禽流感流行的风险,因此做好禽流感的防控工作可以有效保护动物园的珍禽,同时对公共卫生安全具有重要意义。此次珍禽禽流感二价疫苗免疫试验表明,大部分珍禽能产生较好的免疫反应,但品种间,品种内个体间珍禽对疫苗的免疫应答反应差别较大。因此,对动物园珍禽禽流感的防控除应切实做好疫苗免疫接种工作,并定期监测抗体水平,对抗体水平低的珍禽及时加强免疫,从而有效降低其易感性;同时,动物园还应做好消毒工作,尤其是对于外来野鸟飞入动物园内部停靠的地点应加强消毒工作。此外,还应加强动物园野生动物的疫病监测,对于刚引进的珍禽还应做好检疫、隔离工作。总之,对动物园珍禽禽流感的防控须采取综合防控措施。

[1]孙建忠,马永明,韩明良.青海湖鸟岛候鸟发生高致病性禽流感的防控措施[J].黑龙江畜牧兽医,2006,5:91.

[2]梁少浪,骆旭铭,龙彩虹,等.黑天鹅高致病禽流感的诊断和预防[J].中国兽医科技,2004,6:67.

[3]梁少浪,骆旭铭,龙彩虹,等.动物园野生禽类禽流感H5亚型灭活油乳剂疫苗的应用[J].中国兽医科技,2004,8:70-71.

[4]姜北宇,刘月焕,祝俊杰,等.H5亚型禽流感疫苗对特禽及水禽的免疫效果观察[J].中国兽药杂志,2005,9:23-25.

[5]吴艳云,史秋梅,孙好学,等.动物园动物禽流感疫苗免疫后抗体水平检测[J].中国兽医杂志2009,3:85-86.

[6]张苏华,刘佩红,周锦萍,等.新型H5N1亚型禽流感灭活疫苗对鸭、鹅及鸽免疫原性研究[J].中国预防兽医学报,2004,11:401-404.

[7]薛峰,陈浩,彭宜,等.盐城国家级珍禽自然保护区野鸭、天鹅、丹顶鹤禽流感监测分析[J].中国人兽共患病学报,2006,6:565-567.

[8]刘佩红,周锦萍,范宏斌,等.重组H5N1亚型禽流感疫苗免疫孔雀后的抗体消长规律及免疫程序的研究[J].畜牧与兽医,2007,39(12):28-30.

[9]Deibel R,Emord DE,Dukelow W,et al.Influenza viruses and paramy xoviruses in ducks in the Atlantic flyway,1977-1983,including an H5N2 isolate related to the virulent chicken virus[J].Avian Dis,1985,29:970-985.

[10]Chen H,Li Z,Shi J,et al.Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migrato ry waterfowl in Western China[J].Journal of virology,2006,80(12):5976-5983.

[11]曾祥伟,华育平,李晓冰.三江自然保护区野生迁徙水禽携带禽流感病毒和新城疫病毒状况的监测[J].微生物学报,2008,10:1403-1407.