供体年龄对德国肉用美利奴羊超数排卵及胚胎移植效果的影响

左北瑶 ，钱宏光 ，王子玉 ，汪立芹 ，郭志勤

（1.新疆巴州畜牧工作站，库尔勒 841000；2.内蒙古自治区农牧业科学院；3.南京农业大学动物胚胎工程技术中心，江苏 210095；4.新疆畜牧科学院农业部家畜繁育生物技术重点开放实验室）

德国肉用美利奴羊（德美羊）是肉毛兼用品种，繁殖力高、被毛品质好，尤其是肉用性能突出，引入我国后在土种羊改良和细毛羊培育中起了巨大作用，如与中国美利奴羊（新疆型）杂交后，F1代在各阶段平均体重比中国美利奴羊（新疆型）提高0.07～2.10 kg，体尺指标也有明显改善［1］。为进一步提高德美羊的良种覆盖率，亟需采用胚胎移植技术进行快速扩繁。但目前国内关于德美羊超数排卵、胚胎移植的研究较少。为充分利用不同年龄段的良种德国肉用美利奴羊，本试验优化了超排方案，研究了供体年龄与超排和胚胎移植效果的关系，为进一步提高绵羊胚胎移植效率提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 供、受体 供体为纯种德国肉用美利奴羊，按年龄分为青年（18月龄，配种未受胎）、老龄（60～72月龄，经产）以及幼龄母羊（7月龄，性成熟前）3组。受体为新疆地方品种巴音布鲁克成年母羊。

1.2 超排及同期发情药品 促卵泡素（FSH）：宁波三生药业生产；促黄体素（LH）、孕马血清促性腺激素（PMSG）、前列腺素（PG）、促黄体素：宁波生产；Y 形阴道栓（CIDR）、孕酮阴道海绵栓：澳大利亚生产。

1.3 供体的预处理

1.3.1 青年组及老龄组的预处理 间隔11 d 2次肌注PG（0.1 mg/只），挑选出发情时间在 36～48 h之间的母羊作为供体。供体母羊按方案设计分组，其中青年羊9只，老龄羊4只，置入CIDR，在放栓的第13天取出阴道栓，肌注PG 0.1 mg，试情，记录发情日期。随机挑选青年、老龄母羊各2只，在超排处理前情期的第2天分2次间隔12 h肌注FSH 20 u。

1.3.2 幼龄母羊的预处理 每只幼龄母羊肌注500 u的PMSG，挑选3 d内发情的2只作为供体，记录发情日期。

1.4 供体的超排 本试验主要是从漏配或配种未受胎的德美母羊群中选取供体，其繁殖性能参差不齐。为提高供体超排效果，采取了人工诱导发情与自然发情相结合的处理程序，即在诱导发情之后增加一个自然发情周期，在自然发情周期结束前超排。对已同期处理的供体，根据年龄和体重调整FSH剂量，总量为120～200 u，在情期的第13～15天连续3 d减量肌注FSH，并在第3天上午，注第5针FSH的同时注PG 0.1mg。第16天早上开始试情，对发情羊肌注促黄体素100 u，人工授精3～4次（每次间隔12 h）。

1.5 供体的采胚 在供体首次发情配种后第6.5天进行子宫角采胚［2］。在显微镜下判断是否可用及胚胎发育阶段，分为 16细胞（16C）、致密桑椹胚（compaction morula，CM）、囊胚（blastocyst，B）。

1.6 受体同期发情 在供体撤栓后的第4天将孕酮海绵栓置入同组受体阴道中，在放栓后的第10天肌注400u PMSG，第12天撤栓，肌注PG 0.1mg，翌日试情，标记发情羊。

1.7 胚胎移植 采用子宫角移植，选择与供体发情同步（同天或早0.5 d以内）的作为同组供体胚胎的移植受体。以术后2情期未返情判定为妊娠。

1.8 统计分析 试验数据采用SPSS 16.0软件进行方差分析。

2 结果

2.1 供体年龄对德美羊超排效果的影响 由表1可见，15只供体共采集胚胎162枚，只均采胚数10.8枚，其中可用胚胎总数151枚，只均可用胚数为10.1枚，胚胎可用率93.2%。青年、老龄、幼龄母羊超排后只均可用胚数分别为10.9、10.3和6.0枚，青年、老龄组可用胚数显著高于幼龄组（P＜0.05），可用胚率差异不显著（P＞0.05）。单只最多采出可用胚16枚。

表1 供体年龄对德美羊超排效果的影响

2.2 供体年龄与德美羊胚胎发育速度的关系 供体首次发情配种后第6.5天时手术回收胚胎，显微镜下判断各年龄组羊胚胎的发育阶段，结果（表2）表明，回收的胚胎中囊胚所占比例幼龄组（24.9%）、青年组（23.5%）显著高于老龄组（0）（P＜0.05），老龄组胚胎主要为致密桑葚胚（95.1%），说明幼龄、青年组供体的胚胎发育速度显著快于老龄供体。

表2 供体年龄与德美羊胚胎发育速度的关系

2.3 供体超排前预注小剂量FSH对德美羊超排后卵巢黄体数量的影响 在超排处理前情期的第2天，预注小剂量FSH（20 u）的青年组和老龄组供体，其黄体数均显著多于对照组（P＜0.05），老龄供体由10个提高到20个，青年组由12.3个提高到16.5个（表3），说明超排前预注小剂量FSH能显著促进超排后卵泡成熟与排卵。

表3 供体超排前预注小剂量FSH对德美羊超排后卵巢黄体数量的影响

2.4 供体年龄对德美羊胚胎移植受胎率的影响 同期处理受体168只，其中162只受体发情，受体同期成功率96.4%，共移植受体122只，妊娠79只，妊娠率64.8%。青年组、老龄组、幼龄组的妊娠率分别为71.6%、58.3%和41.7%。青年组和老龄组供体母羊胚胎移植后的妊娠率显著高于幼龄组（表4）。

表4 供体年龄对德美羊胚胎移植受胎率的影响

3 讨论

3.1 供体年龄与德美羊超排效果及移植受胎率的关系 供体年龄对超排处理后德美羊回收胚胎数量和胚胎质量具有较大影响。青年、老龄组德美母羊超排后只均可用胚数分别为10.9枚和10.3枚，显著高于幼龄母羊的6.0枚（P＜0.05），表明经产成年母羊和性成熟青年羊的超排效果比幼龄母羊好。这与赵晓娥［3］、张锁林［4］等在波尔山羊、张果平［5］等在杜泊绵羊上的结果类似。青年、老龄组母羊的胚胎经移植后受胎率分别为71.6%、58.3%，显著高于幼龄组的41.7%，说明经产成年母羊和性成熟青年羊所获得胚胎质量相对较高，原因可能是性成熟前幼龄母羊卵巢机能及生殖内分泌系统的调控机能尚不完善，影响了卵母细胞的质量和胚胎发育过程。因卵母细胞的发育能力与供体日龄密切相关［6］，幼龄德美羊卵巢中卵母细胞经超排后虽能排卵和受精，但其中的部分卵母细胞可能胞质成熟不完全。因此选择供体应以经产成年羊为首选，年龄不超过5岁，其次为青年羊；为提早利用优良种畜，缩短世代间隔，也可在7月龄以上的羔羊中初选发育快、体成熟早的个体，在超排程序上先注PMSG催情处理，然后以发情羊为供体超排。

3.2 供体年龄与德美羊胚胎发育速度的关系 6.5 d时回收的胚胎中囊胚所占比例幼龄组（24.9%）、青年组（23.5%）显著高于老龄组（P＜0.05），说明老龄供体的胚胎发育速度相对较慢。为取得更高比例的适龄胚胎，回收胚胎时除要十分重视计算供体的发情配种时段与受体发情时段的准确匹配之外，对供体年龄因素亦不应忽略，如供体整体年龄偏老，采胚手术应适当后延，反之可适当提前；如供体年龄老幼混杂，幼龄羊采胚应在前，老龄羊应在后。

3.3 德美羊超排程序的优化 供体的超排效果取决于两个方面：一是供体本身具备正常的繁殖机能，二是外源激素的剌激与内源的周期协同作用。根据这个原理利用PG处理挑选出繁殖机能正常的母羊，再利用孕酮海绵栓调节发情周期，然后在其自然情期用外源激素进行超排，能够保证较好的超排效果。FSH在卵泡腔的形成过程中起重要作用，能剌激颗粒细胞的有丝分裂和卵泡液的形成，还可以通过增加LH感受器的数目而诱发颗粒细胞对LH的敏感性。母畜在排卵前的20～30 h出现第2次FSH高峰，其目的是启动另一批卵泡形成卵泡腔，为下一个情期排卵做准备。排卵率高的羊此峰值明显高于排卵率低的羊，而且分泌的FSH量与17 d后卵巢上有腔卵泡数量呈正比［7］。本试验表明在超排处理前情期的第2天，用小剂量的FSH肌注做预处理，提高血清中FSH水平可显著提高超排效果，使更多的卵母细胞成熟和排卵，与Armstrong在牛上的结果类似［8］。

4 结论

综上所述，本试验证明供体年龄显著影响德美羊的超排效果及胚胎质量，以青壮年羊（2～5岁）的效果最好，但为了充分利用数量有限的良种个体，也可对老龄和性成熟前母羊进行超排。通过人工诱导发情与自然发情相结合的处理程序和低剂量FSH预处理改善了德美羊的超排效果，为今后进一步提高绵羊胚胎移植的效率提供了依据。

［1］刘武军，杨菊清，喻世刚，等.德美与中美（新疆型）杂交后代体尺体重变化［J］.中国畜牧兽医，2008，35（7）：131-134.

［2］郭志勤.家畜胚胎工程［M］.北京：中国科学技术出版社，1998.

［3］赵晓娥，武浩，权富生，等.波尔山羊胚胎移植试验研究［J］.西北农业学报，2002，11（4）：92-94.

［4］张锁林，王述宇.波尔山羊超数排卵方案的研究［J］.中国草食动物，2001，21（4）：10-14.

［5］张果平，王金文，王德芹，等.影响杜泊绵羊超数排卵效果的因素分析［J］.江苏农业学报，2009，25（2）：324-328.

［6］Armstrong D T.Effects of maternal age on oocyte developmental competence［J］.Theriogenology，2001，55（6）：1303-1322.

［7］R Rajamahendran，R S Cansecoa，C J Denbowa，et al.Effect of low dose of FSH given at the beginning of the estrous cycle and subsequent superovulatory response in Holstein cows［J］.Theriogenology，1987，28（1）：59-65.

［8］Armstrong D T.Recent advances in superovulation in cattle［J］.Theriogenology，1993（39）：7-24.