心脑通络液对脑梗塞大鼠脑组织凋亡基因Bcl-2、p53的影响

2011-06-04 02:33吴限陈鹏
中医药信息 2011年4期
关键词:心脑脑梗塞阳性细胞

吴限,陈鹏

(黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040)

神经元对缺血性损害的敏感性不一,细胞凋亡是一个动态的发展过程,在局灶性脑缺血急性期,神经元坏死与凋亡并存,细胞坏死位于缺血中心区,细胞凋亡主要出现在缺血半暗带,而在脑缺血的迟发性神经元死亡期,则主要表现为细胞凋亡[1]。近年来研究表明,细胞凋亡的过程受多种基因的调控,其中Bcl-2和p53被认为是抑制和促进细胞凋亡最重要的调控基因。我们观察了心脑通络液对局灶性脑缺血大鼠凋亡基因Bcl-2、p53的影响,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康SD大鼠,体质量250~300g,由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供。

1.1.2 药物 心脑通络液:由黄芪、地龙、桃仁、红花、当归尾、赤芍、川芎、太子参、水蛭、菟丝子等组成,水煎后分别浓缩成浓度为0.54ml/ml和0.27ml/ml的药液。步长脑心通(咸阳步长制药有限公司,每粒0.4g,用生理盐水溶解成浓度为0.033g/ml的药液)。

1.1.3 试剂及仪器 Bcl-2试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);p53试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);OLYMPUS光学显微镜(日本BX60);病理图像数码分析系统(麦克奥迪实业集团Med6.0)。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药 动物随机分为5组,即假手术组、模型组、心脑通络液高剂量组(简称高剂量组)、心脑通络液低剂量组(简称低剂量组)、步长脑心通对照组(简称对照组),在造模成功12h后各取8只。高、低剂量组和脑心通组分别于术前5天至处死前每天给予灌胃给药,剂量分别为:高剂量组5.40ml/kg,低剂量组2.70ml/kg,对照组0.33g/kg。假手术组、模型组则予同等体积的0.9%生理盐水灌胃,1日1次。

1.2.2 模型建立 采用线栓法制备大脑中动脉局灶性脑缺血模型,大鼠腹腔内注射20%乌拉坦(6ml/Kg)麻醉后,仰卧固定,颈部正中切口,分离并暴露右侧颈总及颈内、外动脉,并在颈内外动脉分叉处结扎颈外动脉,右侧颈总动脉剪口,插入头端烧成圆钝形直径为0.25mm的尼龙鱼线,进线长度约(18.5±0.5)mm,在大脑中动脉起始端堵塞大脑中动脉,然后将颈总动脉连同尼龙鱼线一起结扎,庆大霉素消毒后逐层缝合切口,外用甲硝唑粉以预防感染。放回笼内,单笼喂养。假手术组只分离、暴露血管,不结扎颈总动脉及颈外动脉,不插入尼龙鱼线。选择苏醒后左上肢屈曲、行走时向左侧旋转或左侧肢体瘫痪的大鼠为栓堵成功者进行实验,否则视为栓堵失败,弃之不用。手术过程中保持大鼠体温在36.5~37.5℃,于造模成功后 6h、12h、24h、48h分批检测 IL-8、TNF-α、SOD、NO 含量的变化。

1.2.3 检测指标及方法

在造模成功12h后,按试剂盒说明书检测Bcl-2及p53。

使用病理图像分析系统对免疫组化染色切片进行分析。在200倍镜下每组随机取8张片,每张片4个视野,经显微镜摄像仪摄入,按512×512像素分布,并保存在病理图像分析系统内,用组化分析进行分析,先进行分割,选择点状分割将阳性物标记为棕黄色,除去非特异染色,记录阳性目标总面积和统计场总面积的比值(面密度),进行统计学处理。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 心脑通络液对脑梗塞大鼠脑组织Bcl-2的影响

结果见表1。

表1 药物对脑梗塞大鼠脑组织Bcl-2的影响(±s)

表1 药物对脑梗塞大鼠脑组织Bcl-2的影响(±s)

注:与同点模型组比较,*P﹤0.05;与同点模型组比较,**P﹤0.01;治疗组与同点假手术组比较,△△P﹤0.01;高低剂量组与同点对照组比较,##P﹤0.01。

假手术组 8 24.54 ±3.20*模型组 8 33.48 ±6.12对照组 8 42.10 ±4.44△△低剂量组 8 55.44±11.38**△△##高剂量组 8 81.35 ±13.65**△△##

结果表明,与模型组比较,脑梗塞12h,假手术组Bcl-2阳性细胞总面积与统计场面积的比值最小,有显著性差异(P<0.05);给予心脑通络液后,脑组织Bcl-2阳性细胞总面积与统计场面积的比值均有不同程度升高,且有显著性差异(P<0.01),以高剂量组降低最为显著(见图1,2)。

图1 Bcl-2模型组200×

图2 Bcl-2高剂量组200×

2.2 心脑通络液对脑梗塞大鼠脑组织p53的影响结果见表2。

结果表明,与模型组比较,局灶性脑缺血12h时,假手术组p53阳性细胞总面积与统计场面积的比值最小,有显著性差异(P<0.01);给予心脑通络液后,脑组织p53阳性细胞总面积与统计场面积的比值均有不同程度降低,且有显著性差异(P<0.01),以高剂量组降低最为显著(见图3,4)。

表2 药物对脑梗塞大鼠脑组织p53的影响(±s)

表2 药物对脑梗塞大鼠脑组织p53的影响(±s)

注:与模型组比较,**P﹤0.01;治疗组与假手术组比较,△△P﹤0.01;高低剂量组与对照组比较,##P﹤0.01。

假手术组 8 22.15 ±3.49**模型组 8 65.09 ±5.13对照组 8 42.69±4.62**△△低剂量组 8 32.65 ±4.06**△△##高剂量组 8 31.03±4.41**△△##

图3 p53模型组200×

图4 p53高剂量组200×

3 讨论

心脑通络液是根据传统的中医理论,在总结历代医家治疗中风病经验的基础上,经多年临床实践研制的治疗脑梗死的有效方剂。该方针对气虚血瘀,脑络闭阻的这一病机特点,采用“补益气血、活血化瘀”为主要治法,治疗上遵循“补虚泻实、攻补兼施”的原则,已广泛应用于临床多年,疗效确切。本实验结果显示,与模型组相比,给予心脑通络液后,脑组织Bcl-2阳性细胞总面积与统计场面积的比值均有不同程度升高,差异有统计学意义(P<0.01),以高剂量组降低最为显著。脑组织p53阳性细胞总面积与统计场面积的比值均有不同程度降低,差异有统计学意义(P<0.01),以高剂量组升高最为显著。表明心脑通络液可促进局灶性脑缺血大鼠脑组织Bcl-2蛋白表达,抑制p53蛋白表达,通过调整凋亡相关基因的表达,抑制神经元凋亡。

[1]孙世晓,刘泓雨,杨春壮,等.电针对局灶性脑缺血大鼠半暗带神经细胞凋亡及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、c-Fos蛋白表达的影响[J].中医药学报,2011,39(1):65-68.

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