心脑通络液对脑梗塞大鼠脑组织凋亡基因Bcl－2、p53的影响

吴限，陈鹏

(黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

神经元对缺血性损害的敏感性不一，细胞凋亡是一个动态的发展过程，在局灶性脑缺血急性期，神经元坏死与凋亡并存，细胞坏死位于缺血中心区，细胞凋亡主要出现在缺血半暗带，而在脑缺血的迟发性神经元死亡期，则主要表现为细胞凋亡［1］。近年来研究表明，细胞凋亡的过程受多种基因的调控，其中Bcl－2和p53被认为是抑制和促进细胞凋亡最重要的调控基因。我们观察了心脑通络液对局灶性脑缺血大鼠凋亡基因Bcl－2、p53的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康SD大鼠，体质量250～300g，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供。

1.1.2 药物 心脑通络液:由黄芪、地龙、桃仁、红花、当归尾、赤芍、川芎、太子参、水蛭、菟丝子等组成，水煎后分别浓缩成浓度为0.54ml/ml和0.27ml/ml的药液。步长脑心通(咸阳步长制药有限公司，每粒0.4g，用生理盐水溶解成浓度为0.033g/ml的药液)。

1.1.3 试剂及仪器 Bcl－2试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);p53试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);OLYMPUS光学显微镜(日本BX60);病理图像数码分析系统(麦克奥迪实业集团Med6.0)。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药 动物随机分为5组，即假手术组、模型组、心脑通络液高剂量组(简称高剂量组)、心脑通络液低剂量组(简称低剂量组)、步长脑心通对照组(简称对照组)，在造模成功12h后各取8只。高、低剂量组和脑心通组分别于术前5天至处死前每天给予灌胃给药，剂量分别为:高剂量组5.40ml/kg，低剂量组2.70ml/kg，对照组0.33g/kg。假手术组、模型组则予同等体积的0.9%生理盐水灌胃，1日1次。

1.2.2 模型建立 采用线栓法制备大脑中动脉局灶性脑缺血模型，大鼠腹腔内注射20%乌拉坦(6ml/Kg)麻醉后，仰卧固定，颈部正中切口，分离并暴露右侧颈总及颈内、外动脉，并在颈内外动脉分叉处结扎颈外动脉，右侧颈总动脉剪口，插入头端烧成圆钝形直径为0.25mm的尼龙鱼线，进线长度约(18.5±0.5)mm，在大脑中动脉起始端堵塞大脑中动脉，然后将颈总动脉连同尼龙鱼线一起结扎，庆大霉素消毒后逐层缝合切口，外用甲硝唑粉以预防感染。放回笼内，单笼喂养。假手术组只分离、暴露血管，不结扎颈总动脉及颈外动脉，不插入尼龙鱼线。选择苏醒后左上肢屈曲、行走时向左侧旋转或左侧肢体瘫痪的大鼠为栓堵成功者进行实验，否则视为栓堵失败，弃之不用。手术过程中保持大鼠体温在36.5～37.5℃，于造模成功后 6h、12h、24h、48h分批检测 IL－8、TNF－α、SOD、NO 含量的变化。

1.2.3 检测指标及方法

在造模成功12h后，按试剂盒说明书检测Bcl－2及p53。

使用病理图像分析系统对免疫组化染色切片进行分析。在200倍镜下每组随机取8张片，每张片4个视野，经显微镜摄像仪摄入，按512×512像素分布，并保存在病理图像分析系统内，用组化分析进行分析，先进行分割，选择点状分割将阳性物标记为棕黄色，除去非特异染色，记录阳性目标总面积和统计场总面积的比值(面密度)，进行统计学处理。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 心脑通络液对脑梗塞大鼠脑组织Bcl－2的影响

结果见表1。

表1 药物对脑梗塞大鼠脑组织Bcl－2的影响(±s)

表1 药物对脑梗塞大鼠脑组织Bcl－2的影响(±s)

注:与同点模型组比较，*P﹤0.05;与同点模型组比较，＊＊P﹤0.01;治疗组与同点假手术组比较，△△P﹤0.01;高低剂量组与同点对照组比较，##P﹤0.01。

假手术组 8 24.54 ±3.20*模型组 8 33.48 ±6.12对照组 8 42.10 ±4.44△△低剂量组 8 55.44±11.38＊＊△△##高剂量组 8 81.35 ±13.65＊＊△△##

结果表明，与模型组比较，脑梗塞12h，假手术组Bcl－2阳性细胞总面积与统计场面积的比值最小，有显著性差异(P＜0.05);给予心脑通络液后，脑组织Bcl－2阳性细胞总面积与统计场面积的比值均有不同程度升高，且有显著性差异(P＜0.01)，以高剂量组降低最为显著(见图1，2)。

图1 Bcl－2模型组200×

图2 Bcl－2高剂量组200×

2.2 心脑通络液对脑梗塞大鼠脑组织p53的影响结果见表2。

结果表明，与模型组比较，局灶性脑缺血12h时，假手术组p53阳性细胞总面积与统计场面积的比值最小，有显著性差异(P＜0.01);给予心脑通络液后，脑组织p53阳性细胞总面积与统计场面积的比值均有不同程度降低，且有显著性差异(P＜0.01)，以高剂量组降低最为显著(见图3，4)。

表2 药物对脑梗塞大鼠脑组织p53的影响(±s)

表2 药物对脑梗塞大鼠脑组织p53的影响(±s)

注:与模型组比较，＊＊P﹤0.01;治疗组与假手术组比较，△△P﹤0.01;高低剂量组与对照组比较，##P﹤0.01。

假手术组 8 22.15 ±3.49＊＊模型组 8 65.09 ±5.13对照组 8 42.69±4.62＊＊△△低剂量组 8 32.65 ±4.06＊＊△△##高剂量组 8 31.03±4.41＊＊△△##

图3 p53模型组200×

图4 p53高剂量组200×

3 讨论

心脑通络液是根据传统的中医理论，在总结历代医家治疗中风病经验的基础上，经多年临床实践研制的治疗脑梗死的有效方剂。该方针对气虚血瘀，脑络闭阻的这一病机特点，采用“补益气血、活血化瘀”为主要治法，治疗上遵循“补虚泻实、攻补兼施”的原则，已广泛应用于临床多年，疗效确切。本实验结果显示，与模型组相比，给予心脑通络液后，脑组织Bcl－2阳性细胞总面积与统计场面积的比值均有不同程度升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，以高剂量组降低最为显著。脑组织p53阳性细胞总面积与统计场面积的比值均有不同程度降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，以高剂量组升高最为显著。表明心脑通络液可促进局灶性脑缺血大鼠脑组织Bcl－2蛋白表达，抑制p53蛋白表达，通过调整凋亡相关基因的表达，抑制神经元凋亡。

［1］孙世晓，刘泓雨，杨春壮，等.电针对局灶性脑缺血大鼠半暗带神经细胞凋亡及凋亡相关基因Bcl－2、Bax、c－Fos蛋白表达的影响［J］.中医药学报，2011，39(1):65－68.