小兴安岭地区主栽黑木耳品种的遗传背景分析

马珂，李滇华，邢振楠，王洪刚，楚金玉

（1.伊春原生态食用菌研究所，黑龙江 伊春 153000；2.黑龙江北方林业有限公司）

小兴安岭伊春地区是我国黑木耳的主产区之一，每年栽培量在4亿袋以上。在黑木耳生产中菌种是基础资料，是影响产品产量和质量的关键因素，优良菌种的选用对整个产业的发展起着重要的作用。由于不同地区和生产厂家频繁相互引种，自主命名，造成生产用菌种命名极为混乱。

针对这一现象，本文采用酯酶同工酶电泳技术，对生物学特性适宜伊春地区栽培的、商品性较好、产量较高的23个黑木耳品种遗传背景进行分析，对它们进行鉴别，同时也为今后的遗传育种工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种及来源

从小兴安岭伊春地区收集得到23个黑木耳主栽品种，用于酯酶同工酶分析（见表1）。

1.2 设备

DYY-10电泳仪、WD-9412A恒温循环器、DYCZ-28A电泳槽、HH-2数显恒温水浴锅、HH-B11-600-S型电热恒温培养箱、TGL-16高速离心机、Gilson移液器、分析天平（精度0.01g、0.0001g各一台）、研钵（备有研杵）等。

表1 供试菌种及其来源

1.3 试剂

三羟甲基氨基甲烷（Tris）、N，N-甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bis）、核黄素、α－乙酸萘酯、β－乙酸萘酯、坚固蓝RR盐，以上试剂均购自Sangon（BBI分装），其它试剂均为国产。

1.4 菌丝培养

1.4.1 培养基配方（LCYM）：葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母浸膏2g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾0.46g，蒸馏水定容1000mL。

1.4.2 培养条件：（25±1）℃避光，静止在培养箱内培养20d。

1.5 酯酶同工酶检测

1.5.1 样品制备。准确称取0.5g菌丝体，加入液氮研磨，将样品收集于1.5mL离心管中，加入1.0mL样品提取液，4℃下10000r／min离心10min，取其上清液与40%蔗糖溶液、溴酚蓝指示剂按5∶1∶1的比例混合，混合液即为电泳样品。

1.5.2 电泳检测。向电泳槽中注用1×Tris－甘氨酸缓冲液，用微量进样器取21μL电泳样品样品孔中，样品先在稳压100V的条件下进行电泳，待样品进入浓缩胶后，把电泳槽放入冰箱内进行低温电泳，待指示剂进入分离胶后，把电压调到200V进行稳压电泳，最后当溴酚蓝指示剂距凝胶底部1cm时，停止电泳。

1.5.3 凝胶染色。倒出1×Tris－甘氨酸缓冲液，卸下胶条，于水中取出凝胶，浸入染色液，室温下染色20min左右，用ddH2O冲洗凝胶，置于7%乙酸溶液中固定，照相（图1、图2）。

1.5.4 数据统计分析。根据电泳结果统计酯酶同工酶条带，条带的有无分别记为1和0，按Nei＆Li（1979）的方法计算各菌种之间的相似系数GS＝2Nij／（Ni＋Nj），式中Ni和Nj分别为I和J两个菌种的总条带数，Nij为两材料的公共条带数。获得相似系数GS矩阵后，应用NTSYS 2.10e软件进行聚类分析，构建遗传相关聚类图。

2 结果与分析

2.1 酯酶同工酶酶谱分析

如图1、图2所示各菌种之间的酶带颜色和宽窄也有差异，可分为四级：一级酶带：色深而宽；二级酶带：色较深而宽；三级酶带：色较浅而窄；四级酶带：色很浅而窄。酶带颜色和宽窄的变化说明了酯酶同工酶的活性和含酶量的差异，色深而宽的酶带酯酶同工酶的活性强、含量高，色浅而窄的酶带酯酶同工酶的活性弱、含量低。

供试23个菌种进行酯酶同工酶电泳分析。酯酶同工酶谱带数在5～10条，共分离出14条迁移率（Rf）不同的多态性酶带，迁移率在0.29～0.85，谱带稳定，重复性高。

2.2 遗传背景分析

根据电泳条带的有、无，分别记为1或0，对稳定、清晰的酶带进行统计，输入计算机，采用NTSYS 2.10e分析软件中的STMQUAL程序计算遗传相似系数，并建立树状图（图3）。

由图3可见，一品黑、A1、长城1号三个菌株间的相似系数达1.0；A8、A4、特产1号三个菌株间的相似系数达1.0；特产6号、A3、林科3号、长白7号、汇丰1号、8129六个间相似系数达1.0。

在遗传相似系数0.62水平上，23个黑木耳菌种聚为为A、B两大类，其中A类在遗传相似系数0.78水平上聚为Ⅰ、Ⅱ两大类，Ⅰ类包括以下品种：一品黑、A1、长城1号、A8、A4、特产1号、特产5号、特产2号、黑29、银珠1号、特产6号、A3、林科3号、长白7号、汇丰1号、8129、特产15号共17个菌株；Ⅱ类品种：A15；其中B类在遗传相似系数0.75水平上聚为Ⅲ、Ⅳ两大类，Ⅲ类包括以下品种：友好918、北青、林科6号、特产3号共四个菌种；Ⅳ类品种：神龙A8。

图1 供试黑木耳菌种（编号1～12）酯酶同工酶电泳图谱

图2 供试黑木耳菌种（编号13～23）酯酶同工酶电泳图谱

图3 23个黑木耳菌种PAGE-EST分析聚类树状图谱

3 讨论

随着生物技术和食用菌产业的发展，同工酶电泳分析在食用菌遗传学和菌种真实性鉴定中得到广泛应用，其中以酯酶同工酶和过氧化酶的应用最多。在酯酶同工酶电泳试验中，由于菌种的酯酶同工酶和其形态特征一样都是菌种的基因型与环境效应相互作用的综合表现的结果，所以酯酶的活性受到外部环境影响比较大，并且具有明显的组织特异性等特点。因此，在应用其进行食用菌种质鉴定、品种鉴别等有关研究工作中，要采用标准化，在相同条件下进行分析，才能建立食用菌菌种的标准酶谱和保证酯酶同工酶的稳定性。

从供试菌种的酶谱带型和聚类分析可以看出，部分菌种之间的带型相似或者相同，相似系数也很高，甚至达到1.0，如一品黑、A1和长城1号；A8、A4和特产1号等一些品种可以初步确定这些菌种间亲缘关系很近。由于菌丝代谢活动差异，酶的活性不同，酯酶同工酶的带数和酶带深浅、宽度等会出现差异，在酶带实际统计分析中都会对分析结果产生影响，特别在聚类等分析中。在今后的研究中应当将PAGE-EST与ISSR、SRAP等标记技术相结合进行综合分析。

本实验表明，23个黑木耳菌种酯酶多态性比较高，共分离到不同迁移率的条带14条，条带类型比较丰富，多数菌种之间存在差异，在相同的实验条件下（菌龄等因素），其稳定性和重复性比较好，并且在一定程度上可以反应出某些菌种之间存在同物异名现象。随着《NY／T 1097-2006食用菌菌种真实性鉴定酯酶同工酶电泳法》的颁布，酯酶同工酶电泳技术以其操作简单、耗时短、费用低和重复性高等特点，在食用菌菌种的真实性鉴定和遗传学等方面的研究依然有比较高的应用价值。

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