雌激素对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的抗炎机制☆

胡晓 朱加应黄伟琨万兴王建怡

实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是一种以特异性致敏的CD4+T细胞介导为主的，中枢神经系统(central nervous system，CNS)内小血管周围出现单个核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病，是国际公认的人类多发性硬化(multiple sclerosis，MS)的动物模型。与其他多种自身免疫性疾病一样，MS存在着性别差异，表现为女性发病率较高与于男性相比，女性发病率较高，且初发时间也较早。在女性MS患者妊娠末期，疾病的严重程度明显减轻，复发时间延长，复发次数明显减少;但是在产后，伴随着雌激素水平的下降，疾病的复发次数增多、症状又逐渐加剧，提示体内高水平雌激素对女性MS患者具有保护作用［1］。雌激素是由芳香化酶催化雄激素转化而来，临床研究表明口服雌激素具有免疫调节效果，可以减少复发－缓解型MS患者钆增强病灶的数量和大小，进一步提示雌激素有可能作为治疗MS的药物靶点［2－3］。研究发现雌激素及雌激素受体α配体能够影响细胞因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、干扰素 γ(interferon γ，IFN-γ)、基质金属蛋白酶-9和白细胞介素(interleukin，IL)-6 等的分泌减轻 MS 或EAE 的发病［4－5］。本实验构建了C57BL/6小鼠EAE模型，予雌二醇治疗，观察其是否通过纠正Th1/Th2型细胞因子的失衡，抑制IL-23/IL-17轴等作用治疗EAE。

1 对象与方法

1.1 研究对象 雌性C57BL/6小鼠60只，4～8周龄，体质量15～20 g，购自重庆医科大学实验动物中心，合格证号:SCXK(渝)2007－000341。

1.2 方法

1.2.1 去卵巢手术及EAE动物模型的制备 将雌性C57BL/6小鼠60只行输卵管结扎及卵巢摘除，术后2周制备EAE模型。用0.01 mol/L的PBS将MOG35-55(西安美联多肽合成有限公司)稀释成300 μg/mL，与等量的完全弗氏佐剂(美国Sigma公司)(卡介苗(中国药品生物制品检定所馈赠)的终浓度为10 mg/mL)混合，用玻璃注射器抽打至油包水状态的抗原乳剂。按0.2 mL/只分别于背部、颈部、腋窝、蹊部四点皮下注射［6］，制作EAE模型。将去卵巢的EAE小鼠分为治疗组和对照组各30只。自免疫第10 d起至免疫后30 d，治疗组予1.2 mg/(kg·d)戊酸雌二醇(补佳乐)(中国先灵公司)生理盐水悬浊液灌胃给药，对照组予同等量的生理盐水灌胃处理。

1.2.2 临床症状评分标准 免疫当日及免疫后所有动物每日称重并进行神经功能评分，EAE模型评分采用较为通用的5分评分法，1分:动物尾部无力;2分:后肢无力;3分:后肢瘫痪;4分:前肢瘫痪;5分:濒死状态或死亡［7］。

1.2.3 标本采集 两组EAE小鼠于免疫后16 d(急性期)、23 d(缓解期)和30 d(慢性期)分3批取脑组织和脊髓，每批10只，除一部分用于H-E染色，余脊髓组织即刻用于抽提RNA，脑组织用无菌生理盐水冲洗后置液氮中速冻，转移至－80℃冰箱备用。

1.2.4 H-E染色 取急性期、缓解期、慢性期EAE小鼠各5只的脊髓和脑组织用4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，制成厚度5 μm的切片，用常规方法行H-E染色。根据文献报道对炎症反应程度进行评分:0分，无炎症细胞浸润;1分，炎症细胞仅浸润在脑表面，即蛛网膜下腔内;2分，轻度炎症细胞脑实质浸润;3分，中度炎症细胞脑实质浸润;4分，重度和弥漫性脑实质见炎症细胞浸润［8］。

1.2.5 实时荧光定量 PCR 检测 IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ、IL-4 mRNA的表达水平 取两组EAE小鼠急性期、缓解期、慢性期脊髓组织，即刻用Trizol(美国Invitrogen公司)提取每个样本的总RNA，BioRT逆转录扩增试剂盒(美国BioFlux公司)逆转录合成cDNA，根据SYBR Master Mixture试剂盒(大连TaKaRa公司)的产品说明书进行实时定量PCR检测。β-actin作为内参，引物由上海生物工程服务有限公司设计并合成。引物序列分别为:IL-23上游5'-ACATGCACCAGCGGGA CATA-3'，下游 5'-CTTTGAAGATGTCAGAGTCAAGCAG-3';IL-17上游5'-ACGCG CAAACATGAGTCCAG-3'，下游 5'-AGGCTCAGCAGCAGCAACA G-3';TNF-α 上游 5'-GCCACAAGCAGGAATGAGAAG-3'，下游 5'-GCCACAAGCAGGAATGAGAAG-3';IFN-γ 上游 5'-TTTGCAGCTCTTCCTCAT-3'，下 游 5'-TGCCAGTTCCTCCAGATA-3';IL-4上游5'-TCTCGAATGTACCAGGAGCCATATC-3'，下游 5'-AGCACCTTGG AAGCCCTACAGA-3';β-actin 上游 5'-GTGGACATCCGCAAAGA C-3'，下游5'-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3'。扩增条件为:95℃预变性30 s;95℃变性10 s，58℃退火15 s，72℃延伸10 s，45个循环;72℃延伸10 min。同时设RT质控和PCR扩增两个空白对照。根据目的基因与内参基因的Ct差值，得到两组标本的 IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ、IL-4相对表达量。

1.2.6 ELISA 方法检测脑组织中 IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ、IL-4的浓度 两组EAE小鼠于免疫后急性期、缓解期、慢性期分3批取脑组织，取部分脑组织，冰上PBS冲洗，滤纸吸干，以生理盐水配成10%脑组织匀浆，匀浆液5 000 r/min，离心半径r=10 cm，低温离心10 min，取上清液，用小鼠 IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ、IL-4 ELISA试剂盒(美国 R＆D公司)，双抗体夹心ELISA 方法检测 IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ、IL-4 浓度，具体方法按ELISA试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1 临床症状评分比较 30只对照组EAE小鼠免疫12 d后开始逐渐发病，表现为活动减少、食欲减退、体重减轻、尾部及四肢无力。发病高峰为14～18 d，高峰过后，EAE小鼠的体重逐渐恢复，症状有所缓解。按照评分标准，大于1分为发病，对照组共28只发病，发病率达93.33%以上，平均丧失最大体质量为(2.966±1.082)g。30只治疗组EAE小鼠免疫14 d后开始逐渐发病，共8只发病，发病率为26.7%，平均丧失最大体重为(0.943±0.488)g。两组临床症状评分(图1A)、发病率、体质量变化(图1B)差异有统计学意义(P ＜0.05)。

2.2 H-E染色 H-E染色见对照组EAE小鼠急性期脑和脊髓有明显的炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主(图2 A)。在缓解期时，炎症细胞的浸润也比较明显，但比急性期有所减轻(图2 B)。慢性期炎症细胞浸润进一步减轻(图2 C)。治疗组各期EAE小鼠CNS内炎症细胞的浸润明显减少(图2 D～F)，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)(图2 G)。

2.3 EAE 小鼠脊髓中 IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ、IL-4 mRNA表达量 对照组EAE小鼠发病高峰过后，体重逐渐恢复，随着症状的缓解，脊髓中IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ mRNA表达量逐渐减低，IL-4逐渐增加。如表1所示，治疗组EAE小鼠发病急性期和缓解期脊髓中 IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ mRNA 表达量及其在脑组织中浓度与对照组相比降低(P＜0.05)，IL-4增加(P＜0.05)，治疗组各指标在慢性期与对照组相比无统计学差异(P＞0.05)。

2.4 EAE 小鼠脑组织中 IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ、IL-4浓度测定 对照组EAE小鼠发病高峰过后，体重逐渐恢复，随着症状的缓解，脑组织中 IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ浓度逐渐减低，IL-4逐渐增加。表2所示，治疗组 EAE 小鼠脑组织中 IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ浓度与对照组相比降低(P＜0.05)，IL-4增加(P＜0.05)。

图1 各组EAE小鼠临床症状评分及体重变化曲线。与对照组相比，＊＊P＜0.001，n=10

图2 H-E染色观察炎症细胞浸润情况。A:急性期对照组EAE小鼠;B:缓解期对照组EAE小鼠;C:慢性期对照组EAE小鼠;D:急性期治疗组EAE小鼠;E:缓解期治疗组EAE小鼠;F:慢性期治疗组EAE小鼠;G:各组EAE小鼠炎细胞浸润的统计学分析，与对照组相比 *P＜0.05，＊＊P ＜0.001，n=5，放大倍数:200×

表1 实时定量PCR

表2 ELISA结果

3 讨论

MS是一种CNS炎性脱髓鞘性自身免疫疾病，细胞因子在其发病机制中起重要作用。研究发现EAE主要是由CD+4 Th1细胞介导的。CD+4细胞分为Th1和Th2两个亚型。Th1型细胞因子如IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α等，能促进炎症的发生，激活巨噬细胞，对脱髓鞘的产生起着极为重要的作用［9－10］;Th2型细胞因子如IL-4、IL-5和IL-10等可以通过下调内皮细胞和巨噬细胞的应急状态参与炎症修复，抑制Th1型细胞因子。因此，Th1/Th2平衡是机体行使防御、自身稳定和免疫监视的重要机制。大量研究表明MS患者中存在Th1/Th2 型细胞因子的失衡［11－12］，纠正这一失衡已成为治疗MS的新策略之一［13］。近年来对于EAE发病机制的研究还提示IL-23/IL-17轴是导致MS和EAE的另外一个重要机制。IL-23能够诱导Th0细胞向高度致炎性的Th17细胞分化，产生IL-17、IL-17F、IL-6及TNF-α［14］。IL-17是 Th17 细胞的主要效应因子，是一种高度致炎性细胞因子，能启动和刺激炎性细胞产生多种炎性细胞因子如 IL-1、IL-6、TNF-α、一氧化氮合酶、金属蛋白酶等［15］。进一步的证据还表明EAE严重程度与血清中IL-17的水平相关［16］。本文的实验结果显示EAE小鼠在慢性期与急性期和缓解期相比，其CNS 中的致炎性因子 TNF-α，IFN-γ，IL-23，IL-17 含量降低、抗炎性细胞因子IL-4的含量增加，表明细胞因子的表达水平与EAE的发病进程密切相关，同时也暗示着纠正Th1/Th2型细胞因子的失衡以及IL-23/IL-17轴异常或许可以影响EAE病情的发生和发展。

雌激素对CNS发挥着重要的调节和保护作用，可影响学习记忆和认知功能，降低老年性痴呆的发病率［17］，减轻脑损伤后脑细胞死亡的程度，提高脑损伤后的恢复能力。EAE鼠的发病情况、症状严重程度与雌激素水平也有一定关系［18］。本实验用雌二醇治疗EAE小鼠，发现经治疗后的EAE小鼠的发病率、症状评分、体重变化、发病日期4项临床指标与对照组相比明显减轻或延迟，表明雌二醇可以显著改善EAE小鼠的病情，提示雌激素能够抑制EAE的炎症反应。我们进一步实时定量PCR和ELISA等实验方法对比两组EAE 小鼠的 CNS 中所含有的 TNF-α、IFN-γ、IL-23、IL-17和IL-4的水平，发现雌二醇可以降低Th1型细胞因子TNF-α、IFN-γ，并增加Th2型细胞因子IL-4的表达。这一结果暗示雌激素可能是通过纠正Th1/Th2型细胞因子的失衡，并影响Th0细胞向Th1细胞及Th2细胞的分化来缓解EAE小鼠的炎症反应。除此以外，我们的实验还显示雌二醇的治疗可以降低炎性细胞因子IL-23和IL-17的表达，提示对于IL-23/IL-17轴的抑制是雌激素发挥抗炎作用的又一重要机制。

综上，雌激素可抑制EAE的发病，其免疫抑制机制并不是单一的，而是多因素多途径共同导致的。本实验应用雌二醇治疗EAE，发现其能改善EAE小鼠的临床表现，进一步的机制性研究则暗示这一保护作用可能是通过纠正Th1/Th2细胞因子的失衡、抑制IL-23/IL-17轴实现的。

［1］Niino M，Hirotani M，Fukazawa T，et al.Estrogens as potential therapeutic agents in multiple sclerosis［J］.Cent Nerv Syst A-gents Med Chem，2009，9(2):87－94.

［2］Sicotte NL，Liva SM，Klutch R，et al.Treatment of multiple sclerosis with the pregnancy hormone estriol［J］.Ann Neurol，2002，52(4):421－428.

［3］Soldan SS，Alvarez Retuerto AI，Sicotte NL，et al.Immune modulation in multiple sclerosis patients treated with the pregnancy hormone estriol［J］.J Immunol，2003，171(11):6267 －6274.

［4］Morales LB，Loo KK，Liu HB，et al.Treatment with an estrogen receptor alpha ligand is neuroprotective in experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.J Neurosci，2006，26(25):6823－6833.

［5］Gold SM，Sasidhar MV，Morales LB，et al.Estrogen treatment decreases matrix metalloproteinase(MMP)-9 in autoimmune demyelinating disease through estrogen receptor alpha(Erα)［J］.Lab Invest，2009，89(10):1076 －1083.

［6］胡晓，袁军，万兴，等.实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的建立及其病理学和影像学表现［J］.贵阳医学院学报，2009，34:78－83.

［7］Legge KL，Min B，Bell JJ，et al.Coupling of Peripheral Tolerance to Endogenous Interleukin 10 Promotes Effective Modulation of Myelin-Activated T Cells and Ameliorates Experimental Allergic Encephalomyelitis［J］.Experimental Medicine，2000，191(12):2039－2052.

［8］王顺和.脱髓鞘病变中轴突损伤的实验研究［J］.第三军医大学学报，2008(30):386－389.

［9］Murphy AC，Lalor SJ，Lynch MA，et al.Infiltration of Th1 and Th17 cells and activation of microglia in the CNS during the course of experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Brain Behav Immun，2010，24(4):641－651.

［10］Lees JR，Iwakura Y，Russell JH.Host T cells are the main producers of IL-17 within the central nervous system during initiation of experimental autoimmune encephalomyelitis induced by adoptive transfer of Th1 cell lines［J］.J Immunol，2008，180:8066 －8072.

［11］Suryani S，Sutton I.An interferon-gamma-producing Th1 subset is the major source of IL-17 in experimental autoimmune encephalitis［J］.J Neuroimmunol，2007，183(1 －2):96 －103.

［12］McGeachy MJ，Anderton SM.cytokines in the induction and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Cytokine，2005，32(2):81－84.

［13］Butti E，Bergami A，Recchia A.IL4 gene delivery to the CNS recruits regulatory T cells and induces clinical recovery in mouse models of multiple sclerosis［J］.Gene Ther，2008，15(7):504－515.

［14］Harrington LE，Hatton RD，Mangan PR.Interleukin 17-producing CD4+effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type I and 2 lineages［J］.Nat Immunol，2005，6(11):1123－1132.

［15］Kawanokuchi J，Shimizu K，Nitta A，et al.Suzumura A.Production and functions of IL-17 in microglia ［J］.J Neuroimmunol，2008，194(1－2):54－61.

［16］Tian AY，Zhang RW，Shi XG，et al.Alteration of T helper cell subsets in the optic nerve of experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Int J Mol Med，2010:25(6):869 －974.

［17］Sarkaki A，Amani R，Badavi M，et al.Pre-treatment effect of different doses of soy isoflavones on spatial learning and memory in an ovariectomized animal model of Alzheimer's disease［J］.Pak J Biol Sci，2008，11(8):1114 －1119.

［18］Garay L，Gonzalez Deniselle MC，Gierman L，et al.Steroid protection in the experimental autoimmune encephalomyelitis model of multiple sclerosis［J］.Neuroimmunomodulation.2008，15(1):76－83.