甲拌磷残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制

魏松红，逄若霖，王 翀，纪明山，谷祖敏，祁之秋，王英姿

甲拌磷残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制

魏松红，逄若霖，王 翀，纪明山，谷祖敏，祁之秋，王英姿

(沈阳农业大学植物保护学院，辽宁 沈阳 110866)

研制用于检测甲拌磷残留量的间接竞争ELISA试剂盒。甲拌磷包被抗原的最佳工作质量浓度为4mg/L，抗体的最佳稀释倍数为8000，甲拌磷多克隆抗体交叉反应率小于20%，甲拌磷抑制率回归曲线为y=18.846x＋6.9949，在1～5000μg/L范围内呈线性关系，检测限为4.90μg/L，IC50为191.37μg/L。甲拌磷试剂盒的添加回收率均高于75%，供试样品检测结果的批内和批间变异系数均低于10%。试剂盒在4℃或-20℃下有效期为270d。

甲拌磷；残留；酶联免疫吸附测定法；试剂盒

甲拌磷[phorate，O,O-二乙基-S-(乙硫基甲基)二硫代磷酸酯]是有机磷类重要的内吸性杀虫杀螨剂，主要用于防治棉花、水稻、小麦、高粱等大田作物上的害虫[1]，为土壤和种子处理剂，高等毒性。甲拌磷在植物体内氧化为更高毒性的氧化物，并有较长的残效期，对人类的健康存在潜在威胁。因此，对甲拌磷残留快速有效的检测方法研究具有一定意义。目前，常见的甲拌磷检测方法为气质联用法和液质联用法[2-3]，由于常规仪器分析方法前处理步骤复杂，费时费力、设备昂贵，需要专业人员操作，不适宜大量样品和现场快速检测。以免疫化学为基础的酶联免疫吸附分析(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)检测方法，具有快速、简便、灵敏、经济的特点，适合大批量样品的检测[4]。Jeffre等[5]利用O,O-二乙基-O-[对-(4-羧基丁基)苯基]硫代磷酸酯作为半抗原制得广谱特异性抗体，采用酶联免疫方法对有机磷类杀虫剂进行检测。刘贤进等[6]采用二乙基膦酸乙酸做为通用结构半抗原制备抗血清，对毒死蜱、辛硫磷等12种常见有机磷农药具有特异性，IC50为0.12～3.8μg/mL。本实验在甲拌磷自主合成人工抗原及制备多克隆抗体的研究基础上[7]，研制甲拌磷间接竞争ELISA试剂盒，并对其性能进行测定，适用于土壤、粮食等样品中甲拌磷残留的分析。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

甲拌磷多克隆抗体 本实验室制备；96孔酶标版JET公司；五硫化二磷 河北世纪农药有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG 中杉金桥有限公司；邻苯二胺(OPD) 中国五联化工厂；0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)；洗涤液：含体积分数0.05%吐温-20的0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液；0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)；封闭液：含5g/100mL胎牛血0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)中定容；底物显色液：10mg邻苯二铵溶于25mL底物缓冲液中，加入10μL质量分数30% H2O2混匀；终止液：2mol/L H2SO4溶液。

Model 680酶标仪 美国Bio-Rad公司；N-1000型旋转蒸发器 日本Eyela公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原、抗体最佳工作浓度的确定

用方阵试验法对间接竞争法ELISA试剂盒中抗原抗体最适工作质量浓度进行选择。0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释成不同质量浓度后，包被酶标板，每一种包被浓度设置不同的抗体质量浓度。OD490nm为1.0左右，抗体抗原用量较少，即为抗体抗原工作质量浓度[8]。

1.2.2 丙酮溶剂对抗原、抗体结合反应的影响

间接竞争ELISA法检测过程中，加入甲拌磷多克隆抗体之前分别添加体积分数为5%、10%、20%和30%丙酮的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)，以不加丙酮为对照，每个处理3次重复，计算抑制率，判断丙酮含量对抗原、抗体结合反应的影响程度，确定丙酮含量。

1.2.3 抗体的特异性检测

交叉反应率是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力，反映了抗体的特异性。利用竞争性抑制试验方法，分别测定抗体与甲拌磷及结构类似物抑制率，以交叉反应率高低比较抗体的特异性[9]。

1.2.4 试剂盒内容及操作方法

试剂盒内容：96孔酶标板(甲拌磷包被抗原包被，2.5%胎牛血清封闭)；甲拌磷多克隆抗体1瓶，1mL；酶标二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG)1瓶，200μL；底物邻苯二胺(OPD)1支，50mg；30%过氧化氢1瓶，每瓶2mL；反应终止液1瓶，10mL；底物缓冲液1瓶，每瓶10mL；0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液1瓶，每瓶30mL；洗涤液1瓶，每瓶30mL，于-20℃下保存待用。

操作方法：取出一块包被有甲拌磷包被抗原且封闭好的酶标板，恢复室温后备用；加入50μL标样或处理好的样品到各孔中；加入甲拌磷多克隆抗体，每孔50μL，37℃孵育1h；倒出孔中的液体，用100μL稀释好的洗涤液洗3次；加入50μL稀释的酶标二抗，37℃孵育1h；倒出孔中的液体，用100μL洗涤液洗3次；加入底物显色液100μL，并在37℃避光显色30min；加入50μL反应终止液，混合好后在490nm波长处测定OD值。

1.2.5 试剂盒的结果判定

配制1、10、50、100、200、500、1000、2000、5000μg/L的甲拌磷溶液，在加入甲拌磷多克隆抗体前分别添加到酶标板中，每个质量浓度重复3次，分别以空白和不加甲拌磷溶液为对照，采用间接竞争ELISA法进行检测。以甲拌磷溶液质量浓度对数为横坐标，抑制率为纵坐标，即得其标准曲线，由图即可得其灵敏度。抑制率计算公式为：

式中：ODmax为不加农药时的光密度；ODx为加农药时的光密度；ODmin为空白对照的光密度。

1.2.6 试剂盒的回收率、精密度和有效期测定

1.2.6.1 样品的前处理

将水稻植株、小麦植株样品切碎，水稻种子、小麦种子、土壤样品直接称量，每份20g分别装入三角瓶中。添加甲拌磷到样品中，每个质量浓度重复3次。在样品中加入90mL丙酮提取5min。提取液用布氏漏斗抽滤，用10mL丙酮冲洗滤渣，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠进行干燥后，用旋转蒸发器浓缩近干，丙酮定容至1mL，进行ELISA分析[9]。

1.2.6.2 加标回收实验

分别取10、100、1000μg/kg的甲拌磷标样添加到样品中，用间接竞争ELISA法测定，根据标准曲线计算出检测的甲拌磷质量浓度，计算添加回收率与变异系数。

1.2.6.3 精密度实验

分别取10、100、1000μg/kg甲拌磷添加到样品中，用间接竞争ELISA法测定其批内和批间变异系数。

1.2.6.4 试剂盒有效期

取同一批次试剂盒分别保存于4℃和-20℃，0、30、60、90、120、150、180、210、240、270d时，使用试剂盒测定添加到土壤中的甲拌磷，通过结果判断试剂盒的有效性。

2 结果与分析

2.1 抗原抗体的最佳工作质量浓度

表1 间接ELISA法中抗原、抗体最适工作质量浓度方阵试验结果Table 1 Optimal concentrations of antigen and antibody during indirect ELISA assay

经方阵实验结果(表1)，OD490nm为1.026时对应的包被抗原和抗体的质量浓度为最适工作质量浓度，即甲拌磷包被抗原的最佳工作质量浓度为4mg/L，抗体的最佳稀释倍数为8000倍。

2.2 丙酮体积分数对抗原、抗体结合反应的影响

由表2可以看出，随着丙酮比例加大，对显色反应的抑制逐渐增大，丙酮体积分数5%时对抗原抗体结合能力影响最小，选定丙酮体积分数为5%。

表2 丙酮含量对抗原、抗体结合反应的影响Table 2 Effect of acetone concentration on conjugation between antigen and antibody

2.3 抗体特异性检测结果

甲拌磷多克隆抗体对结构类似的相关化合物进行交叉反应实验，结果表明该试剂盒与绝大多数有机磷农药没有强烈的交叉反应，与所测有机磷农药的交叉反应率均小于20%(表3)。

表3 抗甲拌磷抗体的特异性实验Table 3 Specificity experiments of anti-phorate antibody

2.4 试剂盒标准曲线及灵敏度

采用间接竞争ELISA法，以标准甲拌磷溶液质量浓度对数(lgC)为横坐标，抑制率为纵坐标，即得其标准曲线：y =18.846x＋6.9949，甲拌磷质量浓度在1～5000 μg/L范围内呈线性关系，相关系数R2=0.9401，最低检测限为4.90μg/L，IC50为191.37μg/L。

2.5 加标回收实验结果

用甲拌磷间接竞争ELISA试剂盒测定5种不同的样品的添加回收率(表4)，结果表明添加回收率均高于75%，变异系数小于10%，说明本方法准确可靠。

表4 ELISA试剂盒测定样品中甲拌磷添加回收率实验结果Table 4 Recovery rate experimental results of samples spiked with phorate determined by ELISA kit

2.6 精密度实验结果

用甲拌磷间接竞争ELISA试剂盒测定5种不同样品的添加量来衡量其精密度(表5)，结果表明试剂盒的批内变异系数在4.18%～7.81%之间，小于8%，批间变异系数在6.17%～8.39%之间，小于9%，说明该试剂盒精密度很好。

表5 ELISA试剂盒测定样品中甲拌磷的精密度实验结果Table 5 Precision experimental results of phorate determination in samples by ELISA kit

2.7 试剂盒有效期实验结果

表6 抗体有效期实验结果Table 6 Experimental results of valid period of ELISA kit

经甲拌磷间接竞争ELISA试剂盒测定土壤中添加样品含量，结果表明试剂盒在4℃和-20℃条件下保存至270d有效(表6)。

3 结 论

本研究在自主合成甲拌磷半抗原，并免疫制得甲拌磷多克隆抗体的基础上[7]，研制了一种适用于检测样品中甲拌磷残留的间接竞争ELISA试剂盒，并对试剂盒的灵敏度、特异性、精密度、准确度和有效期进行测定。研制的试剂盒检测限为4.90μg/L，IC50为191.37μg/L，线性检测范围1～5000μg/L，交叉反应率小于20%，供试样品检测结果的批内、批间变异系数均低于10%，回收率均高于75%，试剂盒在4℃或-20℃下至少可保存270d，试剂盒稳定性较好。目前，甲拌磷在粮食作物上不允许残留，本研究研制的试剂盒可通过加强免疫，提高抗血清的效价，进一步提高灵敏度，使其更好地应用到环境及食品中的甲拌磷残留检测。

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Development of Indirect ELISA Kit for Detecting Phorate Residue

WEI Song-hong，PANG Ruo-lin，WANG Chong，JI Ming-shan，GU Zu-min， QI Zhi-qiu，WANG Ying-zi
(College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

An indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)kit was developed to monitor phorate residue. The optimal concentration of coating antigen was 4 mg/L and the optimal dilution ratio of antibody was 8000. The cross-reaction ratio was less than 20%. The regression equation of inhibition rate for phorate was y = 18.846x＋6.9949 with a linear detection range of 1-5000μg/L. Results indicated that the detection limit was 4.90μg/L and IC50was 191.37μg/L. The recovery rates were higher than 75%. The intra-assay and inter-assay coefficients were less than 10%. The developed kit can be stored at 4℃ or -20 ℃ for 270 days.

phorate；residue；enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)；kit

S482.4

B

1002-6630(2011)04-0284-04

2010-04-14

沈阳农业大学中、青年硕士生导师资助项目

魏松红(1974—)，女，副教授，博士，研究方向为农药学。E-mail：songhongw125@163.com