基于壳聚糖-纳米金修饰的酪蛋白免疫传感器的研制

汤俊琪，庞广昌*，梁新义，冯苍松

基于壳聚糖-纳米金修饰的酪蛋白免疫传感器的研制

汤俊琪，庞广昌*，梁新义，冯苍松

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

在玻碳电极表面修饰壳聚糖和纳米金，以纳米金对抗体等生物分子的良好亲和性，固定抗-αs-酪蛋白(antiαs-酪蛋白)抗体制得酪蛋白免疫传感器。通过循环伏安法考察电极表面的电化学特性，并对该免疫传感器的性能进行研究。该免疫传感器对以磷酸盐缓冲液溶解的αs-酪蛋白进行检测。响应电流与酪蛋白抗原质量浓度的对数在1～10000ng/mL的范围内线性相关。该免疫传感器制作简单，成本较低，操作方便，可应用于牛奶质量和非乳蛋白掺杂使假的检测。

免疫传感器；壳聚糖；纳米金；酪蛋白；计时电流法；生物传感器；玻碳电极；循环伏安法

壳聚糖(chitosan，CHIT)是天然高分子聚合物甲壳素的脱乙酰基产物，价格低廉，来源广泛，具有可降解性、良好的成膜性、良好的生物相容性、很好的化学修饰能力等性能[1-3]。近年来被广泛应用于生物传感器中做为酶、抗体等生物大分子的固定材料。纳米金溶胶又叫胶体金(nano-gold，NG)，其表面活性位点较多，吸附力强，表面反应活性高，对生物分子具有较好的亲和性[4]。能和生物分子中的-SH、-NH2、-CN等功能基团相互作用，并通过静电吸附，形成Au -S共价键等方式将抗体、酶等生物分子固定而不影响其生物活性，在生物传感器的制作中被普遍使用[5-7]。对于壳聚糖-纳米金复合材料仿生膜构造新型生物传感器，并应用于临床、医药、环境、食品、化工等领域，一直是生物传感器领域研究的热点。

牛奶已经由个别群体的营养保健品转变为大众食品，特别是婴幼儿和老年人的高营养食品，其质量安全是人命关天的大事。牛乳蛋白质中大约80%是酪蛋白，其中αs-酪蛋白质量浓度15～19g/L，它一般不受季节、饲料的影响，浓度恒定，且结构相对稳定。检测αs-酪蛋白的含量，就可判断乳品是否掺假[8-10]。

国内外对牛奶中酪蛋白的测定研究，主要有疏水层析法[11]、毛细管电泳法[12]、高效液相色谱法、酶联免疫法[13]等方法。为简化测定过程，缩短测定时间，降低测定成本等，Hiep等[14]利用局部表面等离子体共振法(localized surface plasmon resonance，LSPR)的免疫传感器对酪蛋白进行测定研究。本实验利用壳聚糖-纳米金复合材料仿生膜固定抗-αs-酪蛋白(anti-αs-酪蛋白)抗体制作了简易的新型电流型免疫传感器，采用免疫竞争法对以磷酸盐缓冲液溶解的anti-αs-酪蛋白进行测定。该免疫传感器制作简单，使用方便，具有很好的应用价值。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

anti-αs-酪蛋白(本实验以αs-酪蛋白免疫新西兰大白兔，提纯免疫血清获得)；αs-酪蛋白 美国Sigma公司；氯金酸 天津科密欧仪器公司；壳聚糖(脱乙酰度90%) 济南海得贝海洋生物工程有限公司。

1g/100mL壳聚糖溶液：1g壳聚糖溶于100mL 体积分数1%的醋酸溶液中；H2O2(质量分数为30%) 广州化学试剂厂；K3Fe(CN)6；乙醇胺；磷酸盐缓冲液(PBS，称取KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，双蒸水溶解定容至1000mL)。所用试剂均为分析纯；实验用水均为二次蒸馏水。

CHI760D电化学工作站 上海辰华仪器有限公司；三电极系统：工作电极为玻碳电极(GCE，Φ=3mm)，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为铂丝电极；DK-8B型电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司；超声洗涤仪 昆山市超声仪器有限公司；电热恒温水浴器 上海一恒科学仪器有限公司；3K15高速冷冻离心机 美国Sigma公司。

1.2 纳米金的制备

纳米金由柠檬酸钠在微波炉中还原获得。100mL 0.1g/L的氯金酸溶液在微波炉中先高档沸腾2min。迅速一次加入4mL 1g/100mL柠檬酸三钠水溶液，再放入微波炉中，中挡保持3min，得到透明的酒红色溶液，即为15nm左右的纳米金[15]。

1.3 免疫传感器的制作

1.3.1 玻碳电极的预处理

玻碳电极用a-Al2O3(粒度0.03μm)悬浊液抛光，双蒸水冲洗，于双蒸水中超声15s清洗干净，在1mmol/L K3Fe(CN)6(含0.2mol/L KNO3)溶液中以循环伏安法扫描表征，然后电极分别在7.25mol/L硝酸溶液、丙酮中悬置浸泡10min，最后在2.2mol/L HNO3与2.5g/100mL K2CrO7溶液中于+1.5V恒电位氧化1min，使玻碳电极表面生成较多的羧基(-COOH)，双蒸水冲洗干净，晾干备用。

1.3.2 NG/CHIT/GCE电极的制备

以微量进样器取5μL 1g/100mL的壳聚糖溶液滴加到处理后的玻碳电极表面，置于50℃烘箱中2h，冷却至室温。在50g/L NaOH溶液中浸泡5min，双蒸水冲洗后在双蒸水中浸泡30min，然后置于纳米金溶胶中浸泡30h，每隔6h冲洗一次。最后可以看到电极表面修饰有一层金黄色的纳米金膜，即得NG/CHIT/GCE电极。

1.3.3 抗体的固定

将NG/CHIT/GCE电极浸泡在用PBS pH7.0稀释的anti-αs-酪蛋白溶液中，4℃放置过夜，取出，水洗；然后电极置于1mol/L乙醇胺中37℃温育1h，以封闭活性基团，以含体积分数1% Tween-20的PBST溶液洗净，置于4℃冰箱中保存待用。

1.3.4 自组装过程的电化学特征

利用循环伏安法表征电极在自组装过程中不同阶段的循环伏安图。采用三电极系统，免疫传感器为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，于1mmol/L K3Fe(CN)6(含0.2mol/L KNO3)溶液中在0.6～-0.1V电位范围扫描，扫描速度0.05V/s。

1.3.5 免疫电极测定过程

采用计时电流法直接测量，计时电流法实验在PBS缓冲液中进行计时电流法测定时，工作电位为-0.35V。

2 结果与分析

2.1 电极自组装过程中的电化学特性

电极每次修饰后，在4mL1.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]＋0.2mol/L KNO3溶液中，以0.6～-0.1V的电位范围，0.05V/s的扫描速度进行循环伏安测定，所得CV曲线如图1所示。

图1 电极预处理的循环伏安图Fig.1 Cyclic voltammogram of the pretreated electrode

由图1曲线a可见，裸电极经过打磨后，Fe(CN)63-探针分子在其上有一对对称的氧化还原电流峰，峰电位为Ep,a=0.306V，Ep,c=0.234V(vs.Ag/AgCl)，Ip,a/Ip,c=1。当电极在7.25mol/L硝酸溶液和丙酮中浸泡后，在+1.5V条件下，用2.2mol/L和2.5g/100mL K2CrO7溶液处理60s，探针分子的还原峰电位(Ep,c)负移、氧化峰电位(Ep,a)正移，氧化、还原峰电流都有明显的减小(曲线b、c)，表明电极表面的(-COOH)基团增多，具有较高的负电荷密度，与同样带负电荷的Fe(CN)63-之间由于静电作用相互排斥，阻碍Fe(CN)63-到达电极表面，从而阻止了其在电极表面的电子传递。曲线b、c的氧化还原电流峰的变化不是特别明显。说明电极表面已经相对干净和产了相对饱和的羧基基团。电极达到预处理的要求。

当电极逐层修饰上壳聚糖和纳米金后，氧化、还原峰电流都有明显的增大(图2曲线c)，而刚刚修饰上壳聚糖后，由于壳聚糖对Fe(CN)63-/Fe(CN)64-的电子传递存在一定的阻碍作用，其氧化还原峰明显下降(曲线a)，随后修饰纳米金，电流峰值剧增，说明壳聚糖在电极表面形成薄层且对纳米金有很好的吸附作用，曲线c明显增大的峰电流，表现了纳米金出色的电子传递能力。壳聚糖层修饰的工作电极直接浸入纳米金中，往往容易脱落而进入纳米金溶胶中而且很容易使纳米金溶胶变性失效，本实验将电极经过NaOH溶液处理5min，然后双蒸水冲洗干净，很好的解决这个问题。

图2 玻碳电极的修饰的循环伏安图Fig.2 Cyclic voltammogram of the modified electrode

2.2 免疫电极的电化学特性

免疫电极同样在4mL1.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]＋0.2mol/L KNO3溶液中，以0.6～-0.1V的电位范围，0.05V/s的扫描速度进行循环伏安法表征。可以发现当NG/CHIT/GCE电极固定有抗体后，峰电流出现了非常大的变化(图3曲线c→b)。这是由于在抗体被固定到电极表面，形成了蛋白分子层，阻碍电子的传输(图3曲线b)，当电极在αs-酪蛋白溶液中浸泡后，由于酪蛋白和抗体发生抗原抗体反应形成免疫复合物，致使峰响应电流进一步下降。酪蛋白质量浓度越高，形成的免疫复合物膜就越厚。当酪蛋白质量浓度很高时，生成的免疫复合物使得Fe(CN)63-通过困难，峰响应电流变得非常小(图3曲线a)。

图3 免疫电极和对抗原测定的循环伏安图Fig.3 Cyclic voltammograms of the immunosensor andαs-casein detection

2.3 免疫电极对酪蛋白的测定

将制备好的免疫电极在空白PBS溶液中以-0.4V恒电位计时电位法进行测定后，免疫电极分别在不同质量浓度的酪蛋白抗原溶液中37℃水浴5min，然后在相同电位下同样进行计时电位测定(图4)。选定第30秒为标准，以电流强度(μA)和αs-酪蛋白抗原质量浓度(ng/mL)的对数做图可知，对数在1～10000ng/mL的范围内呈线性关系，线性回归方程为：I=-0.0562lgc＋1.8494，线性相关系数r=0.9402。

图4 免疫电极对不同质量浓度的αs-酪蛋白抗原的电流响应Fig.4 Amperometric response curves for the determination ofαs-casein

2.4 免疫传感器的重现性和稳定性

将该制作好的免疫传感器在100ng/mL αs-酪蛋白抗原溶液中反复测定4次，测定结果的RSD为3.8%(n=4)，表明该免疫传感器具有良好的重现性；对于该免疫传感器的保存方法和稳定性能，仅将该免疫传感器在4℃冰箱环境中干态放置，相隔24h对同质量浓度的αs-酪蛋白抗原溶液进行测定，结果表明电流响应值产生了较大的漂移，只有前一次测定的79.3%，由于产生较大的变化未进行更长时间的保存探讨，但此结果表明，一方面说明该传感器的稳定性还需要进一步的研究，另一方面寻找合适的保存方法如适当的缓冲溶液保存，或者在室温下保存，这些还有待讨论研究。以提高免疫传感器在实际应用中的测定能力。总体来说，这种新型免疫传感器的研制出现，为其应用于牛奶中进行安全检测将提供一条崭新的思路。

3 结 论

在玻碳电极表面修饰壳聚糖纳米金仿生膜后，利用纳米金对抗体具有良好的亲和固定作用而制备出了一种价廉，简便的免疫传感器。应用该免疫传感器对酪蛋白进行测定，结果表明其具有很广的测定范围和很低的测定极限。可为特异性定量检测酪蛋白以及乳品质量与非乳蛋白掺杂使假检测提供新的方法和思路。

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Development of Casein Immunosensor Modified by Chitosan and Nano-Gold

TANG Jun-qi，PANG Guang-chang*，LIANG Xin-yi，FENG Cang-song
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

A novel casein immunosensor for detectingαs-casein was developed through the modification of chitosan and nanogold on the glassy carbon electrode. The modification procedure was electrochemically monitored by cyclic voltammetry to explore the characteristics of the electrode surface and the performance of the immunosensor. The developed immunosensor was used to detectαs-casein in phosphate buffer. An excellent linear range between response current andαs-casein concentration was observed in the concentration range of 1-10000 ng/mL. Therefore, this developed immunosensor is characteristics of simple preparation, low cost, convenient operation, and can be applied to the safety detection of milk.

immunosensor；chitosan；nano-gold；casein；chronoamperometry；biosensor；glassy carbon electrode；cyclic voltammetry

TS201；O657.32

B

1002-6630(2011)04-0280-04

2010-04-01

“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD04A00)；天津市自然科学基金项目(06YFJMJC12600)

汤俊琪(1984—)，男，硕士研究生，主要从事生物传感器及电化学分析的研究。E-mail：tangjunqi1984@163.com

*通信作者：庞广昌(1956—)，男，教授，博士，主要从事食品免疫化学及食品生物技术的研究。E-mail：pgc@tjcu.edu.cn