NF-κB抑制剂PDTC对小鼠肝癌细胞生长的影响

何顺亮，司 敏，周海华，余文娟，宋瑞祥，施广霞，郭连英，郝 冰

(大连医科大学 1.临床医学七年制2006级，2.临床医学2007级，3.病理生理教研室，辽宁 大连 116044)

核转录因子NF-κB是首先由Sen、Baltimore、Mercurio等,在1986年从成熟B 淋巴细胞和浆细胞核的抽提物中发现的核蛋白因子,因能与免疫球蛋白的κ轻链基因内含增强子的特异性序列(即κB序列,10bP : 5’-GGGACTTTCC-3’)特异结合并促进κ链基因表达而被称为核因子κB ( nuclear factor - κB,NF -κB)[1，2]，该因子是一个由复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族,包括Rel ( c - Rel) ,RelA(p65) ,RelB,NF -κB1 (p50)和NF -κB2 (p52、p49、p50B)。NF -κB是真核生物中广泛存在的一种多向性、多功能的核转录因子，可调控细胞凋亡、增殖的相关基因,在细胞癌变过程中发挥重要作用。抗氧化剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐 (Pyrro1idine dithiocarbamate ,PDTC) 是NF-κB的特异性抑制剂，PDTC可抑制淋巴瘤、乳腺癌和卵巢癌等肿瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡，抑制促炎性因子的分泌[3-5]。本实验用体外细胞培养和体内抑瘤实验研究PDTC 对小鼠腹水型肝癌Hca-F的抗肿瘤作用。

1 材料和方法

1.1 动 物

Balb/c小鼠，无特定病原体， 雌雄各半，共20只，体重雌鼠18～32 g，雄鼠27～39 g。

1.2 药品、试剂与器材

PDTC购于sigma公司； MTT购于Amresco公司，生产批号：0793；DMSO购于天津市光复精细化工研究所，生产批号：060831，丙二醛(Maleic Dialdehyde MDA)试剂盒购于南京建成生物工程研究所。低温高速离心机(EVOLUTION TMKC，美国)，酶标仪(BIO-RADmodel550，日本)。

1.3 肿瘤细胞株

小鼠Hca-F细胞株为源自小鼠肝癌细胞H22的高淋巴道转移亚系，常规传代保种。

1.4 体外实验

1.4.1 实验方法[6]：(1) 标本处理：无菌条件下取小鼠腹水0.1 mL加于预盛有PBS缓冲液3 mL的离心管中，离心弃上清，用PBS缓冲液2 mL冲洗后离心3遍，加含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基(1640全培基，下同)吹打成细胞悬液，计数并调浓度至1×106细胞/mL。(2)细胞培养：细胞悬液加入96孔培养板中(200 μL /孔)，设空白对照组(1640全培基)、细胞对照组(肿瘤细胞+1640全培基)、实验组(肿瘤细胞+含PDTC全培基)。每组设3个复孔，对照孔不加药物。PDTC 用药组分别加入4种不同的浓度的PDTC，从低到高依次为12.5 μg/mL、 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL。37℃,5%CO2下培养培养24 h或8 h，每孔加入20 μL 5%MTT，继续培养4 h，离心去上清，加入DMSO 150 μL/孔，于微量振荡器上振荡10 min，使蓝紫色结晶完全溶解，最后放入酶标仪上以570 nm波长检测吸光度值(absorbance,A)。重复3遍。

1.4.2 计算抑制率：按照实体瘤体外敏感标准[7]，抑制率>30%为敏感，<30%为耐药。以抑制率≥70% 为体外高度敏感，50% ≤抑制率<70% 为中度敏感，30% ≤ 抑制率<50%为低度敏感。抑制率=[(细胞对照组平均A值-实验组平均A值)/(细胞对照组平均A值-空白对照组平均A值)]×100% 。

1.5 体内实验

(1)动物分组：20只小鼠，雌雄各半，每只鼠右侧腋下皮下接种Hca-F癌细胞1×106/0.2 mL·只，随机分为攻击对照组、PDTC治疗组。(2)给药方法：PDTC治疗组腹腔注射0.25 g/mL PDTC溶液0.2 mL，攻击对照组腹腔注射生理盐水 0.1 mL/25 g。(3)指标观察：给药后每日测量肿瘤体积和体重，用药结束后处死小鼠后取小鼠的肿瘤并记录体重和瘤重。(4)去除肿瘤中的脂肪和纤维组织，采取10倍稀释制备肿瘤组织匀浆，按照丙二醛(malondialchehyche，MDA)试剂盒说明书操作测定MDA含量，采用放射免疫法检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)含量。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 PDTC对肝癌细胞的体外增殖影响

用含有PDTC的完全培养基培养Hca-F细胞24 h或8 h后用MTT法检测细胞的增殖活性，结果显示PDTC对Hca-F细胞的增殖有抑制作用，浓度为25 μg/mL对Hca-F细胞的抑制作用较强， PDTC浓度作用曲线见图1。

2.2 PDTC治疗对小鼠肿瘤体积和瘤重的影响

PDTC治疗接种肿瘤的小鼠10 d，每天测量肿瘤体积，活杀小鼠测瘤重，结果表明PDTC对肿瘤生长没有明显的抑制作用，与对照组比较差异无显著性意义，结果见图2和3。

图1 PDTC 对Hca-F细胞增殖的抑制作用

图2 PDTC治疗后Hca-F瘤体积的变化

图3 PDTC治疗后Hca-F瘤重的变化

2.3 MDA检测结果

取小鼠肿瘤组织进行MDA试剂盒检测，PDTC组小鼠肿瘤组织匀浆MDA含量为(0.041889±0.00219)μmol/g，攻击对照组为(0.039111±0.00388)μmol/g，两组之间的差异无显著性意义(P>0.05)。

2.4 TNF-α放射免疫检测结果

注射PDTC组的小鼠肿瘤组织匀浆中TNF-α的含量(1.809±2.315) ng/mL低于生理盐水的小鼠肿瘤组织(2.233±2.561)ng/mL，但两组间比较，差异无显著性意义(P>0.05)。

3 讨 论

一些体内外的实验研究表明,抑制肿瘤细胞NF-κB的活性将引起肿瘤细胞的凋亡,从而抑制肿瘤的生长,增加肿瘤细胞对放疗和化疗的敏感性,促进肿瘤细胞凋亡[8]。作为NF-κB的抑制剂PDTC如能应用于临床的肿瘤治疗，则能减少化疗药物的严重毒副作用和化疗耐药的发生率,延长化疗耐药产生时间从而进一步提高化疗效果[9,10]。而本实验为探索NF-κB的抑制剂PDTC对于某些肿瘤细胞是否的确存在抑制作用，其作用的体内外差异是否存在，这些问题对于未来的肿瘤化疗有着重要的意义。

体外MTT法发现PDTC对于Hca-F的增殖有明显的抑制作用，在浓度为25 μg/mL时抑制率明显较高。而体内实验以小鼠为模型，观察瘤重及其体积可发现药物对肿瘤并无明显的抑制作用，反而大部分注射PDTC个体的瘤体积有增大的趋势。MDA是细胞脂质过氧化的产物，可以反映氧化损伤的程度[11]，本实验中作为药物疗效的指标，TNF-α是NF-κB的靶基因之一，检测肿瘤组织匀浆中TNF-α水平以反映NF-κB活化情况，在本实验中PDTC治疗组和攻击对照组之间的差异无统计学意义，不能排除药物剂量低的可能性，也可能因为肿瘤组织的氧化应激水平不明显。体内抗肿瘤实验与体外细胞毒实验的结果差别很大，还可能与NF-κB的多功能和PDTC作用机制有关，因为PDTC是通过抗氧化作用抑制氧化应激诱导的NF-κB活化，对其他因素引起的NF-κB活化的抑制作用可能有限。NF-κB活化有其抑制肿瘤细胞凋亡和促进增殖的作用，抑制其活化与功能在体外环境中可能有抗肿瘤作用，但NF-κB活化可促进多种具有抗肿瘤作用的细胞因子产生，从而增强机体的抗肿瘤免疫，抑制NF-κB的功能对抗肿瘤免疫不利。确切机制有待深入研究。

参考文献:

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[3] Nuutinen U,Simelius N,Ropponen A,et al.PDTC enables type I TRAIL signaling in type II follicular lymphoma cells[J].Leukemia Res,2009,33(6):829-836.

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[7] 辛华雯，陈肖嘉，杜光祖，等.十种抗癌药物敏感性试验方法与临床相关性研究[J].中国医院药学杂志，1994，14(12)：548-550,576.

[8] Karin M,Cao Y,Greten FR,et al.NF-κB in cancer: from innocent bystander to major culprit[J].Nature Rev,2002,2301-2310.

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[10] Rodriguez FH,Nelson S,Kolls JK.Cytokine therapeutics for infectious diseases[J].Curr Pharm Des,2000,6(6): 665-680.

[11] Wang Q,Zou L,Liu W,et al.Inhibiting NF-κB activation and ROS production are involved in the mechanism of silibinin′s protection against D-galactose-induced senescence[J].Pharm Biochem Behav,2011,98:140-149.