顺铂体内注射对子代豚鼠耳蜗毛细胞的影响

郝 帅，闫艾慧，姜学钧

(中国医科大学 第一临床医院 耳鼻咽喉科，辽宁 沈阳 110001)

顺铂以其广谱高效性在抗肿瘤治疗中被普遍应用，但其肾毒性和耳毒性的副作用使得目前临床应用被严格控制[1]，特别是顺铂可造成听功能永久性损伤[2]。本研究组前期实验发现孕晚期顺铂暴露致子代豚鼠毛细胞损伤及听力下降，但孕期顺铂暴露致子代出生后毛细胞损伤的研究未见报道。因此，本实验通过检测顺铂能否诱导毛细胞凋亡，为顺铂耳毒性研究及其防护提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

顺铂注射剂为齐鲁制药产品，兔抗Caspase-3多克隆抗体为美国Cell Signalling Techenology公司产品，TUNEL试剂盒为美国BD Biosciences公司产品；冰冻切片机位德国SLEE公司产品，光学显微镜为日本Olympus光学工业产品。

1.2 实验动物

健康白色红目受孕豚鼠12只(体重600～700 g)，中国医科大学动物部提供。双侧耳廓反射灵敏，在安静的环境下饲养。实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2003-0009；使用许可证号：SYXK(辽)2003-0013。

1.3 动物分组与处理

随机分成两组，每组6只，从孕50 d至56 d连续腹膜内注射：(1)对照组：生理盐水1.5 mg/kg·d；(2)顺铂组：顺铂1.5 mg/kg·d。子代出生后14 d，分离仔鼠右侧耳蜗，行TUNEL染色和Caspase-3免疫组化染色。

1.4 耳蜗冰冻切片制备

快速打开胸腔，左心室穿刺，接灌流液，右心耳剪开。先以4℃生理盐水经心脏灌流，待右心耳处流出液体为无色时，改以4℃新鲜配置的4%多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH=7.4)约300 mL灌流固定。快速断头，取双侧听泡4%多聚甲醛溶液固定24 h，10%甲酸-甲酸钠常温脱钙1周。30%蔗糖4℃过夜，聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物冰冻切片包埋剂包埋，恒冷箱切片机沿蜗轴平行方向行10 μm厚连续切片。

1.5 Caspase-3免疫组化检测

冰冻切片干燥及过氧化物酶阻断后，室温孵育10 min，PBS冲洗5 min，3次。滴加山羊血清封闭，室温孵育50 min，滴加一抗，4℃过夜。PBS冲洗5 min，3次。滴加生物素标记二抗，室温孵育50 min。PBS冲洗5 min，3次。滴加链霉素亲和素过氧化物酶溶液，37℃孵育30 min，PBS冲洗5 min，3次。DAB显色，苏木素复染，常规酒精梯度脱水，二甲苯透明，甘油封片。在400倍光镜下行细胞计数，做到计数区域相同。将每个标本共3个视野的阳性细胞数取平均值，做为该标本的阳性细胞数，所得数据进行统计学处理。

1.6 TUNEL染色

冰冻切片干燥及过氧化物酶阻断后，室温孵育10 min，PBS冲洗5 min，3次。0.1 mol/L TBS 1∶100新鲜稀释蛋白酶K 37℃消化10 min，按每张切片取末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和DIG-d-UTP各1 μL，加10 μL抗体稀释液，每片加标记液20 μL，湿盒37℃孵育2 h，PBS冲洗5 min，3次。滴加封闭液，每片50 μL，室温孵育50 min，PBS冲洗5 min，3次。用抗体稀释液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体，每片50 μL，37℃孵育30 min，PBS冲洗5 min，3次。DAB显色，苏木素复染，常规酒精梯度脱水，二甲苯透明，甘油封片。光镜下观察TUNEL阳性反应细胞并计数和统计。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 顺铂对豚鼠母体生殖指标及仔鼠体重的影响

两组在母体生殖指标和子代体重间比较，差异无显著性意义(P>0.05)。见表1。

表1 母体生殖指标和子代体重比较

2.2 顺铂对子代豚鼠Caspase-3在耳蜗毛细胞表达的影响

顺铂组子代豚鼠出生后14 d，在耳蜗毛细胞可见棕黄色颗粒(A，黑色箭头)，Caspase-3阳性染色明显；对照组阳性染色不明显(B)。见图1。

2.3 顺铂对子代豚鼠耳蜗毛细凋亡的影响

顺铂组(A)子代豚鼠出生后14 d，耳蜗部分毛细胞核呈棕褐色染色，大小不一，形态不规整且排列紊乱，呈明显凋亡；对照组(B)核内无棕褐色着染,形态规整,排列整齐,阳性染色不明显。见图2。

3 讨 论

顺铂造成听功能损伤的副作用已得到广泛证实，顺铂耳毒性损伤机制可通过多种途径表现，即直接损伤内耳蓄积、影响内耳代谢、改变血清电解质平衡及氧化应激损伤等[3]。本研究采用低剂量孕晚期给药，借以模拟人群病理状态。哺乳动物孕期毛细胞的正常分化，对其成熟后听功能建立非常重要[4]。顺铂暴露可造成机体内分泌系统紊乱，从而导致机体生理状况改变[5]。但本研究结果显示，顺铂并未影响豚鼠母体产子数和子代体重，这可能与给药剂量、方式及给药持续时间有关。本研究所采用剂量为1.5 mg/kg·d，孕晚期连续7 d给药，该剂量及给药方式不会在动物实验中引起明显听力损伤[6]，而且在停药4周后外毛细胞可有部分恢复[7]，耳蜗功能在8周后可恢复[8]。由此证明，本研究所采用顺铂剂量对母鼠是可代偿的。

图1 子代豚鼠毛细胞Caspase-3表达(免疫组化染色 400×)

图2 子代豚鼠耳蜗毛细胞凋亡(TUNEL染色 400×)

但本研究发现，顺铂可经胎盘诱导子代豚鼠耳蜗毛细胞凋亡发生。TUNEL染色是对完整的凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，通过检测细胞凋亡的启动阶段，由细胞内内源性核酸内切酶激活所造成的DNA片段的3’羟基末端，确定细胞凋亡的发生，用以反映细胞凋亡典型的生物化学和形态学特征[9]。Caspase-3是Fas通道细胞凋亡蛋白级联反应中的核心蛋白，在凋亡的启动过程中发挥重要作用，被认为是最重要的执行者，它由上游的Caspase(Caspase-8、Caspase-9或Caspase-10)激活并水解为活性酶形式，Caspase-3特异性地激活核酸内切酶，后者被释放出来，随后引起DNA迅速片段化[10]，对细胞凋亡是必需条件。抑制Caspase-3酶活性或拮抗Caspase-3功能可使细胞凋亡受抑。本研究结果显示，顺铂暴露诱导子代豚鼠Caspase-3在耳蜗毛细胞表达增加。由此提示，顺铂可经胎盘损伤子代耳蜗毛细胞发育，可能是通过触发Caspase-3参与的级联效应，继而活化引起子代毛细胞形态上的改变，从而促进凋亡完成。

参考文献：

[1] Cohen SM,Lippard SJ.Cisplatin:from DNA damage to cancer chemotherapy[J].Prog Nucleic Acid Res Mol Biol,2001,67(1):93-130.

[2] Devarajan P,Savoca M,Castaneda MP,et al.Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells:role of death receptor and mitochondrial pathways[J].Hear Res,2007,174(1-2):45-54.

[3] Santos NA,Cat o CS,Martins NM,et al.Cisplatin-induced nephrotoxicity is associated with oxidative stress,redox state unbalance,impairment of energetic metabolism and apoptosis in rat kidney mitochondria[J].Arch Toxicol,2007,81(2):495-504.

[4] Cotanche DA.Genetic and pharmacological intervention for treatment/prevention of hearing loss[J].J Commun Disord,2008,41(5):421-443.

[5] Ognio E,Chiavarina B,Peterka M,et al.Study of feasibility of the treatment with procainamide hydrochloride and cisplatin in pregnant mice [J].Chem Biol Interact,2006,164(3):232-240.

[6] Heijmen PS,Klis SFL,De Groot JCMJ,et al.Cisplatin ototoxicity and the possibly protective effect of α-melanocyte stimulating hormone[J].Hear Res,1999,128(1):27-39.

[7] Cardinaal RM,de Groot JC,Huizing EH,et al.Cisplatin-induced ototoxicity:morphological evidence of spontaneous outer hair cell recovery in albino guinea pigs? [J].Hear Res,2000,144(1):147-156.

[8] Stengs CHM,Klis SFL,Huizing EH,et al.Cisplatin-induced ototoxicity; electrophysiological evidence of spontaneous recovery in the albino guinea pig[J].Hear Res,1997,111(1):103-113.

[9] Loo DT.In situ detection of apoptosis by the TUNEL assay:an overview of techniques[J].Methods Mol Biol,2011,682(1):3-13.

[10] Watanabe K,Inai S,Jinnouchi K,et al.Expression of caspase- activated deoxyribonuclease (CAD) and caspase 3 (CPP32) in the cochlea of cisplatin (CDDP)-treated guinea pigs [J].Auris Nasus Larynx,2003,30(3):219-225.