复方中草药免疫增强剂对仔鸡免疫效果的影响

张桂枝,靳双星

(郑州牧业工程高等专科学校畜牧系,河南郑州450011)

近年来,由于长期大量滥用药物、不合理的疫苗接种及免疫抑制病的持续存在导致畜禽机体免疫机能下降,抗病力降低。因此,如何激活机体的免疫系统,提高机体的特异性和非特异性免疫,增强机体的抗病能力是国内外学者一直关注的焦点问题。目前,解决免疫抑制最有效的办法就是使用免疫增强剂。现已研究表明,很多药物,如胸腺素、转移因子、白介素、左旋咪唑等均能通过各自独特的方式调节机体的免疫机能,但这些物质均有一定的副作用,而且有些药物价格昂贵,在临床上很难大规模推广应用。中草药是中华民族的瑰宝,资源丰富,品种繁多。现代医学研究表明[1-4],许多中草药对机体的细胞免疫和体液免疫均有增强或调节作用,可提高机体的抗病力和抵抗力,作为免疫增强剂具有成本低、疗效可靠、使用方便、便于推广等优点。本试验利用天然中草药,经过筛选科学配伍出复方中草药免疫增强剂,研究其对蛋仔鸡免疫效果的影响,为其临床及生产应用提供理论依据及实践指导。

1 材料与方法

1.1 复方中草药免疫增强剂的组成 鱼腥草、金银花、黄芪、柴胡和甘草等,按一定比例称取粉碎,加入适量的蒸馏水,置于锅内煎3次,合并滤液,然后浓缩成每毫升药液含1 g原药,装瓶灭菌备用。

1.2 主要试剂 伴刀豆素球蛋白A(ConA),Sigma公司生产;四甲基偶氮唑蓝(MT T),Sigma公司生产;RPMI 1640培养基,Gibco公司生产;淋巴细胞分离液,上海恒信化学试剂有限公司生产;二甲基亚砜(DMSO),分析纯,天津化学试剂一厂生产;新生小牛血清(自制)。ND-LaSota油乳剂灭活苗、新城疫标准抗原、新城疫标准阳性血清,均为乾元浩生物有限公司产品;1%红细胞悬液(自制)。

1.3 主要仪器 DG5033A型酶联免疫检测仪,南京华东电子有限公司;CO2培养箱,美国Revco公司生产;倒置显微镜,重庆光学仪器厂生产。

1.4 试验动物 1日龄健康罗曼褐雏公鸡,购于郑州市绿野种鸡场孵化场,隔离饲养至15日龄,选取240羽发育均匀的雏鸡供试验用。

1.5 试验动物分组 将供试的240羽15日龄健康罗曼雏公鸡,随机分为4组,每组60只。第1～3组为试验组,在免疫的同时,饮水中加入复方中草药免疫增强剂,连用1个月,第Ⅰ组添加量为1.5%,第Ⅱ组添加量为1%,第Ⅲ组添加量为0.5%,第Ⅳ组为疫苗对照组。均在15日龄时接种ND-LaSota油乳剂灭活苗0.5 mL/只。每组隔离饲养,四组的饲料成分及饲养管理方式完全相同。

1.6 血清中新城疫抗体效价的测定 采用HA-HI试验。分别于免疫前和免疫后第7、14、21天和第28天,每组随机抽取8只鸡,经翅静脉采血,分离血清,测定其新城疫抗体效价,抗体效价的高低用n log2表示。

1.7 免疫器官指数 免疫后第14天和第28天,每组选取10只鸡,颈静脉放血致死,迅速摘取脾脏和腔上囊,进行称重并计算其免疫器官指数 。计算公式如下:免疫器官指数=免疫器官重量(g)/试验阶段体重(kg)。

1.8 T淋巴细胞增殖测定[5-6]采用M TT法。于免疫后第7、14天和第21天,每组随机抽取6只鸡,自心脏采血,肝素抗凝,测定其外周血淋巴细胞增殖。取抗凝血2 mL,加等量 Hank′s液稀释后,用毛细吸管沿管壁缓缓加入装有2 mL淋巴细胞分层液的离心管内,使血液重叠于分层液上,2 000 r/min离心20 min,吸取中间云雾状的白细胞层,移入无菌离心管,适量Hank′s液洗涤2次,2 000 r/min离心10 min,弃去上清液。用RPMI 1640营养液(含10%小牛血清)稀释成1×107个/mL细胞的细胞悬液,加入终浓度为 10 μ g/mL的ConA,接种到96孔细胞培养板中 100 μ L/孔,再加 RPMI 1640培养液100 μ L/孔,然后置于 40℃5%CO2条件下培养44 h后取出,每孔加入M TT 10 μ L,继续培养 4 h,2 000 r/min离心10 min弃去上清液,加入150 μ L DMSO溶液,将细胞板置于微量振荡器上振荡5 min,使沉淀完全溶解,用酶标仪在570 nm波长测定其OD值,作为T淋巴细胞增殖的指标。

1.9 数据分析 用SPSS 11.5软件统计进行分析。

2 结果与分析

2.1 新城疫抗体效价的动态变化 免疫前各组的抗体效价无显著差异(P＞0.05),免疫后第 7、14、21天和第28天,试验组的抗体效价均高于或显著高于疫苗对照组,且Ⅰ、Ⅱ两组的抗体效价显著高于Ⅲ组(P＜0.05)。但在免疫后第7天和第14天,Ⅲ组抗体效价与疫苗对照组比较,差异不显著(P＞0.05)。免疫后的第21天和第28天,Ⅲ组抗体效价与疫苗对照组相比差异显著(P＜0.05)。Ⅰ、Ⅱ两组之间无显著差异(P＞0.05)。试验结果见表1。

表1 疫苗免疫后各组ND-HI抗体效价变化

2.2 免疫器官指数的变化 饮用中草药免疫增强剂之前各组的腔上囊、脾脏指数无差异,饮用中草药免疫增强剂之后的第14天和第28天,三个试验组的腔上囊、脾脏指数均呈上升趋势。且试验组的腔上囊、脾脏指数均高于对照组,Ⅰ、Ⅱ组显著高于Ⅲ组(P＜0.05),但Ⅰ组与Ⅱ组相比差异不显著(P＞0.05),Ⅲ组与对照组相比差异不显著(P＞0.05)。试验结果见表2。

表2 中草药免疫增强剂对免疫器官指数的影响

2.3 外周血T淋巴细胞增殖的变化 饮用中草药免疫增强剂之前各组的OD值无差异,饮用中草药免疫增强剂之后的第7、14天和第21天,试验组的OD值均高于或显著高于对照组,且Ⅰ、Ⅱ组的OD值高于Ⅲ组但差异不显著(P＞0.05)。其中在饮用中草药免疫增强剂之后的第7天试验组的OD值与对照组相比差异不显著(P＞0.05),饮用中草药免疫增强剂之后的第14天和第21天,试验组的OD值均显著高于对照组(P＜0.05)。试验结果见表3。

表3 中草药免疫增强剂对T淋巴细胞增殖的影响

3 讨论

体液免疫是指由抗原刺激B淋巴细胞,引起B淋巴细胞活化、增殖与分化,形成浆细胞并产生抗体,抗体效价的变化反映了机体的体液免疫状态。免疫器官的发育状态和机能强弱直接决定着家禽全身的免疫水平。免疫器官重量的增加可提示机体免疫机能提高,重量减轻可提示机体免疫状况变差。T淋巴细胞主要介导细胞免疫,T淋巴细胞的增殖是评价细胞免疫功能的一个重要指标,采用 MT T法测得的OD值与淋巴细胞增殖率呈正比。本研究结果表明,饮用复方中草药免疫增强剂之后,试验组的抗体效价、腔上囊及脾脏指数和淋巴细胞增殖不同程度地高于疫苗对照组。说明复方中草药免疫增强剂能够促进抗体的生成,增强机体的体液免疫功能;能够促进雏鸡免疫器官的发育,增加其相对重量;能够促进外周血淋巴细胞的增殖,增强机体的细胞免疫功能。

[1]王福传,韩一超,赵洪恩,等.复方中草药免疫增强剂对鸡免疫器官组织形态学影响[J].中国预防兽医学报,2001,23(6):419-421.

[2]Chen Z S,Tan B K H,Chan S H.Activation of T lymphocy tes by polysaccharide-protein complex from Lycium barbarum L[J].International Immunopharmacology,2008,8(12):1663-1671.

[3]Liu Y B.Chemical and immune functions and clinic of preparations of Echinacea purpurea[J].World Phy taned,2001,16(2):47.

[4]Chen H L,Li D F,Chang B Y,et al.Effects of Chinese herbal polysaccharides on the immunity and growth performance of young broilers[J].Poult Sci,2003,82:364-370.

[5]杨发龙,岳华,罗薇,等.MT T法检测鸡外周血淋巴细胞增殖性反应的最佳条件探讨[J].西南民族学院学报,2002,28(2):214-215.

[6]郑铁锁,王贵平,胡元亮,等.复方中草药对雏鸡外周血 T淋巴细胞增殖的影响[J].畜牧与兽医,2010,42(2):110-111.