2株H3N8亚型禽流感病毒HA和NA基因遗传变异分析

屈素洁,郑 敏,梁 媛,莫胜兰,陆文俊,粟艳琼,胡 杰,李 军,刘 棋

(广西动物疫病预防控制中心,广西南宁 530001)

2株H3N8亚型禽流感病毒HA和NA基因遗传变异分析

屈素洁,郑 敏,梁 媛,莫胜兰,陆文俊,粟艳琼,胡 杰,李 军,刘 棋*

(广西动物疫病预防控制中心,广西南宁 530001)

采用RT-PCR技术扩增了2株H3N8亚型流感毒株A/duck/Guangxi/69/2009和A/chicken/Guangxi/2117/2010的HA和NA基因,并与GenBank中收录的其他毒株序列进行比较分析和遗传进化分析。结果表明,分离株的HA与NA基因全长分别为1 733 bp、1 432 bp。A/duck/Guangxi/69/2009株的HA基因与A/duck/Siberia/100/01株的相似性最高,A/chicken/Guangxi/2117/2010株的HA基因与A/white munia/HongKong/4519/00株的相似性最高;而 A/duck/Guangxi/69/2009株的 NA基因与A/duck/Eastern China/91/09株的相似性最高,A/chicken/Guangxi/2117/2010株的 NA基因与A/aquatic bird/Korea/KN-1/04株的相似性最高。2株H3N8禽流感病毒位于同一分支,同源关系较近。2株H3N8禽流感病毒的HA推导的氨基酸剪切位点序列均为P-E-K-Q-T-R,为典型低致病性禽流感病毒的特征序列。

禽流感病毒;HA基因;NA基因;序列分析

*通讯作者

禽流感(Avian influenza,AI)是由正黏病毒科A型流感病毒属流感病毒引起的一种禽类烈性传染病,不仅对养禽业危害严重,而且严重威胁人类健康[1]。根据禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)粒子表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的抗原性的不同,目前将其分为 16个HA亚型和9个NA亚型[2-3]。抗原漂移(antigenic drift)和抗原转变(antigenic shift)导致AIV变异频繁,同一血清型的各亚型间基因序列差异较大,即使同一亚型内核苷酸序列也有差异。

野生水禽是流感病毒的基因储存库和新毒株的重要来源,已知全部16种HA亚型和9种NA亚型AIV均可从水禽分离到[4],说明水禽在流感病毒的进化和生态分布中具有重要作用。目前我国家禽饲养量大、范围广,广大农村主要是粗放型养殖,自由散养的鸭、鸡和野禽常混在一起,并共用同一水源,这为AIV的传播创造便利条件[5-6]。对家禽进行长期的AIV分子流行病学监测,密切关注其传播和进化情况,具有重要的公共卫生学的意义。本研究对市场监测中分离到的2株H3N8亚型AIV的HA和NA基因序列进行序列测定,分别与GenBank选取的国内外H3亚型及N8亚型禽流感病毒代表株进行同源性比较,分析其遗传进化关系。旨在从分子生物学角度了解H3N8亚型AIV在广西的遗传变异情况,为禽流感的防控提供基础信息。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和试剂 禽流感病毒A/duck/Guangxi/69/2009和A/chicken/Guangxi/2117/2010由广西动物疫病预防控制中心分离鉴定和保存;T rizol试剂为Invitrogen公司产品;AMV逆转录酶及相关试剂、TaqDNA聚合酶、Agarose Gel DNA Purification Kit、pMD-18T载体等,均为宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.1.2 引物 依据GenBank上发表的H3N8亚型AIV HA和NA基因片段两端核苷酸保守序列采用Primer6.0软件分别设计出2对引物,HA基因引 物 为 HA-U:5′-AGCAAAAGCAGGGGATACTT-′3,HA-L:5′-AGGTGCAACATT TGCAT TTGAGTA-′3,预 期扩增 HA 基因 片段为1733bp。NA 基 因 引物 为 NA-U:5′-TGTATCAAAAGCCGGAGTT-′ 3,NA-L:5′-CT TCCCT TTGACATCGATAAAGG-′3,预期扩增 NA基因片段为1 432 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。反转录引物为通用引物Un12:5′-AGCAAAAGCAGG-′3

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取 取250 μL病毒尿囊液 ,加入 750 μL Trizol试剂,混匀后室温静置 5 min,加入200 μL氯仿,轻微振荡混匀,4 ℃12 000 r/min离心 10 min,取上清约 500 μL,加入 0.5 mL异丙醇,混匀后室温静置10 min,12 000 r/min离心10 min,沉淀干燥后悬于适量的DEPC处理水中备用。

1.2.2 RT-PCR 取病毒 RNA 悬液 15 μL,与反转录引物(流感病毒通用引物)1 μL(20 pmol/μL)混合,加入 AMV 逆转录酶 5×buffer 5 μL、dNTP(10 mmol/L)2 μL 、RNasin 1 μL(20 U)、AMV 逆转录酶1 μL(5 U),加DEPC处理水补总体积 25 μL。混合物置于42℃作用60 min。PCR反应体系为10×Taq聚合酶缓冲液 5 μL,dNTPs(10 mmol/L)2 μL,上、下游引物(20 pmol/μL)各 1 μL,cDNA 2.5 μL,TaqDNA 聚合酶 1 μL(5 U),用无菌水补足至50 μL。PCR反应条件:95℃,2 min;94℃,45 s,55℃,45 s,72℃,2 min,35个循环;72℃ ,10 min。取PCR产物6 μL在10 g/L琼脂凝胶上电泳检查结果。

1.2.3 PCR产物的回收、克隆和序列测定 PCR产物用Agarose Gel DNA Purification Kit回收后,与pMD-18T载体连接、转化,蓝白斑筛选重组质粒并用PCR鉴定。每个样品挑取阳性克隆,由宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。

1.2.4 同源性分析和进化树构建 应用DNA Star软件对测序基因片段进行拼接和氨基酸序列推导,利用GenBank中的BLAST软件查找核苷酸和氨基酸的同源序列,应用ClustalX1.83软件进行序列比对并用MEGA3.1软件绘制遗传进化树。

2 结果

2.1 HA和NA基因扩增

经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定,扩增到的HA基因片段长约1.7 kb,扩增到的NA基因片段长约1.4 kb,两个基因的扩增结果与预期扩增长度一致(图1)。

图1 HA和NA基因扩增结果Fig.1 PCR amplification results of HA gene and NA gene

2.2 HA和NA基因核苷酸序列与氨基酸分析

序列测定结果已经登录到GenBank,登录号分别 为 HQ647010、HQ874606、HQ647011 和HQ874607。测序结果表明,所扩增的 HA基因编码区均由1 701个核苷酸组成,编码567个氨基酸,不存在核苷酸缺失。整个编码区含有18个保守的半肌氨酸(Cys),具有H3亚型AIV的6个保守的潜在糖基化位点,5个在 HA1区(位于第22/24、38、54、181、301位氨基酸),1个在HA2区(第 499位氨基酸),在144和145位氨基酸处(以 H3的ORF计)不存在香港近年陆生家禽分离株的天冬氨酸残基(Aspartic acid)的插入[7]。推导氨基酸序列分析结果表明,2株H3N8广西分离株在HA裂解位点处均只含有1个碱性氨基酸,具有典型的低致病性AIV株特征。

所扩增的NA基因编码区均由1 413个核苷酸组成,编码471个氨基酸,不存在核苷酸缺失。在整个蛋白质氨基酸序列中,预测共有6个潜在的糖基化位点。与其他毒株的NA一样,在相似的位置上共有17个半胱氨酸残基,维持NA蛋白分子空间构象的半胱氨酸残基基本保守,一些具有重要功能的结构域的氨基酸残基也高度保守。这些都说明蛋白质维持其空间构象所必要的氨基酸位点是相对稳定的,其他有差异的氨基酸位点是禽流感病毒亚型多样性的具体表现。

2.3 HA和NA基因同源性及遗传进化分析

将本试验的测序结果与国内外具代表性的同亚型分离株进行比较,结果表明,2株广西分离毒株HA基因核苷酸序列同源性89.4%,氨基酸序列同源性为95.4%。广西分离株与参考毒株HA基因的核苷酸序列同源性为82.8%～98.8%,氨基酸序列同源性为92.4%～98.4%。A/duck/Guangxi/69/2009与A/duck/Siberia/100/01和A/aquatic bird/Hong Kong/399/99的核苷酸序列同源性最高,分别为94.6%和94.1%。A/chicken/Guangxi/2117/2010与A/white munia/Hong Kong/4519/00的核苷酸序列同源性最高,为97%。

2毒株NA基因核苷酸序列同源性89.3%,氨基酸序列同源性为93.8%。广西分离株与参考毒株HA基因的核苷酸序列同源性为 77.2%～97.9%,氨基酸序列同源性为84.7%～98.2%。A/duck/Guangxi/69/2009与A/duck/Eastern China/91/09的核苷酸序列同源性最高,为97.9%。A/chicken/Guangxi/2117/2010与A/aquatic bird/Korea/KN-1/04的核苷酸序列同源性最高,为95.5%。

2个毒株的HA基因、NA基因与GenBank中相应流感基因片段的遗传进化关系见图2和图3。

图2 HA基因遗传进化树Fig.2 Phylogenetic tree of HA gene

从图2可见,A/duck/Guangxi/69/2009HA基因与2001年俄罗斯鸭源毒株A/duck/Siberia/100/01及1999年香港分离的水禽源毒株A/aquatic bird/Hong Kong/399/99的亲缘关系最近,它们可能来源于同一祖代毒株,而A/chicken/Guangxi/2117/2010株的HA基因与A/white munia/Hong Kong/4519/00株的亲缘关系最近,并且它们处于同一分支,由共同祖先演化而来。

从图3可以看出,N8基因分为2个亚系。A/duck/Guangxi/69/2009 NA基因与2000年中国东部鸭分离株A/duck/Eastern China/91/09亲缘关系最近,而A/chicken/Guangxi/2117/2010株的NA基因与A/aquatic bird/Korea/KN-1/04株的亲缘关系最近。另外,这两株的NA基因与南昌鸭源A/Duck/Nanchang/1681/92和韩国鸡源 A/chicken/Korea/164/04(H9N8)禽流感分离株也有较近的亲缘关系,它们可能来源于同一个进化组群。

图3 NA基因遗传进化树Fig.3 Phylogenetic tree of NA gene

3 讨论

禽流感病毒的血凝素(HA)蛋白在感染过程中被水解为HA1和HA2两条肽链,是病毒感染细胞的先决条件;另外,HA的变异性很强,是病毒发生抗原变异的主要原因;HA还是病毒毒力和宿主特异性的主要决定因素[8-10]。大多数高致病力毒株的HA在其裂解位点附近有多个碱性氨基酸插入,在无类胰蛋白酶的情况下就能发生裂解,造成感染禽全身系统衰竭,导致死亡。低致病力毒株的HA在其裂解位点附近通常只有1个或没有碱性氨基酸,故只能被有限的细胞内蛋白酶所识别,造成温和感染或不表现临床症状[11-12]。本研究发现2个H3N8广西分离毒株HA裂解位点的氨基酸序列均为P-EK-Q-T-R,符合低致病性禽流感裂解位点的氨基酸序列特征。

HA上潜在的糖基化位点是影响AIV毒力的因素之一。受体结合位点的裂解位点附近的糖基化位点可能影响到蛋白酶对HA前体蛋白的裂解,裂解位点糖基会影响AIV和宿主细胞的结合水平[13]。附近糖链的存在干扰了泛素蛋白酶进入裂解位点。对这2份分离株HA基因潜在的糖基化位点进行了分析,结果发现6个潜在的糖基化位点均较为保守,未出现缺失现象。除了A/chicken/Guangxi/2117/2010第24位发生变异以外,在其余各糖基化位点均未发生变异,糖基化位点相对比较保守。

从HA和NA基因进化树上看,A/duck/Guangxi/69/2009和A/chicken/Guangxi/2117/2010株处于同一个较大的分支内,同源关系较近。此2株是本实验室在2009年—2010年期间分别在广西两个不同地区的活禽市场分离到的毒株,地缘关系较远。出现以上结果说明这两株毒株可能来源于同一个祖先,只是在传播的过程中发生了一定的变异。

分离毒株的HA基因与西伯利亚和香港分离株A/duck/Siberia/100/01和A/aquatic bird/Hong Kong/399/99同源性较高;NA基因与韩国分离株A/aquatic bird/Korea/KN-1/04同源性较高。所以,我们有理由相信分离病毒或其HA和NA片段最初是由其他地区的野鸟等禽类传入广西家禽的,所以必须引起高度重视。

H3N8亚型AIV致病力较低,其在流行病学中的作用常被忽视。流感病毒基因组分节段的特性使得基因重排成为其快速变异的重要机制之一,许多研究表明,LPAIV可以通过基因重排为感染人类的流感病毒或禽流感病毒提供基因来源。因此,在加强对高致病性禽流感监测和研究的同时,也必须要对LPAIV的遗传进化情况给予足够重视,加强对低致病性禽流感发生流行的风险评估。

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Genetic Variation Analysis of HA and NA Genes of Two Isolates of Avian Influenza Virus Subtype H3N8

QU Su-jie,ZHENG Min,LIANG Yuan,MO Sheng-lan,LU Wen-jun,SU Yan-qiong,HU Jie,LI Jun,LIU Qi

(Guangxi Center for Animal Disease Control and Prevention,Nanning,Guangxi,530001,China)

The HA and NA genes of two H3N8 subtype avian influenza viruses A/duck/Guangxi/69/2009 and A/chicken/Guangxi/2117/2010 were amplified by RT-PCR and then sequenced.Nucleotide sequences of the HA and NA gene of the two isolates were 1 733 bp and 1 432 bp in length,respectively.T he results of the comparative sequence analysis showed that the A/duck/Guangxi/69/2009 shared high identity with A/duck/Siberia/100/01,and A/chicken/Guangxi/2117/2010 shared high identity with A/white munia/Hong Kong/4519/00 in HA gene,A/duck/Guangxi/69/2009 shared high identity with A/duck/Eastern China/91/09,and A/chicken/Guangxi/2117/2010 shared high identity with A/aquatic bird/Korea/KN-1/04 in NA gene.The phylogenetic analysis results showed the two H3N8 subtype avian influenza viruses were located in the same phylogenetic branch.The sequence on cleavage site of HA proteins of two H3N8 isolates were both P-E-K-Q-T-R,so these two viruses belonged to low pathogenic avian influenza viruses.

Avian influenza virus;HA gene;NA gene;sequence analysis

S852.659.5;Q785

A

1007-5038(2011)09-0041-05

2011-04-08

国家科技重大专项子课题(2009ZX10004-214)

屈素洁(1982-),女(壮族),广西南宁人,硕士研究生,主要从事畜禽传染病学及分子病毒学研究。