贵州省五个猪场蚊蝇携带PRRSV的调查*

路宪礼,周碧君,2*,王开功,2,文 明,2,程振涛,2,罗 意,江 楠,2

(1.贵州大学动物科学学院,贵州贵阳 550025;2.贵州省动物疫病研究室,贵州贵阳 550025)

贵州省五个猪场蚊蝇携带PRRSV的调查*

路宪礼1,周碧君1,2*,王开功1,2,文 明1,2,程振涛1,2,罗 意1,江 楠1,2

(1.贵州大学动物科学学院,贵州贵阳 550025;2.贵州省动物疫病研究室,贵州贵阳 550025)

为监测猪场内的蚊蝇是否能携带猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),采集贵州省5个养猪场蚊蝇样本,采用RT-PCR方法引物蚊蝇样本进行PRRSV N基因检测,对检测为阳性样本的PRRSV-NSP2基因进行克隆并测序,最后对NSP2基因进行生物信息学分析。结果显示,从花溪、乌当、毕节3个地方猪场的蚊蝇样本中均扩增出372 bp左右的片段。贵州省蚊蝇样本的3株PRRSV-NSP2基因的核苷酸序列之间存在较高的同源性,可达97.9%～98.3%;蚊蝇样本的PRRSV-NSP2基因片段与贵州猪场猪源PRRSV流行株相比具有较高的核苷酸同源性,高达97.6%～100.0%,与国内最近流行变异毒株的核苷酸同源性为84.3%～98.8%,而与早期国内外分离经典毒株的核苷酸同源性为77.1%～97.7%。结果表明,从贵州省几个猪场内采集的蚊蝇携带PRRSV。

猪繁殖与呼吸综合征病毒;蚊蝇;克隆与序列分析

*通讯作者

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗称猪蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的猪的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为主要特征的传染病。该病1987年首次在美国暴发后不到10年时间几乎传遍全世界养猪国家[1]。2006年以后,我国发生了由PRRSV变异毒株引起的高致病性PRRS疫情,给养猪业造成了巨大经济损失[2-5]。

猪是PRRSV的自然感染宿主,传染源有感染猪、公猪精液、污染的用具和车辆等[6],而气溶胶、家蝇和刺扰伊蚊等可传播或携带该病毒[7]。史开志等[8]报道贵州省多个养殖场的三带喙库蚊体内也能携带猪繁殖与呼吸综合征病毒[7-8]。为调查蚊蝇在传播PRRSV的生物媒介关系,本研究对采集自贵州省部分养猪场蚊蝇样本进行PRSSV携带情况和所携带毒株变异情况分析,为进一步证实蚊蝇成为猪繁殖与呼吸综合征病毒的携带者提供科学依据,试验结果对防控猪繁殖与呼吸综合征有着重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1待检蚊蝇样本及阳性对照 蚊蝇样本采自贵州省花溪、乌当、毕节、贵阳康宝和六盘水养殖场(蚊蝇种类主要有三带喙库蚊、凶小库蚊、中华按蚊、白纹伊蚊和果蝇等),各场蚊蝇约200只,混合装于灭菌离心管,低温装送至实验室,置-80℃保存备用。阳性对照为贵州大学预防兽医学实验室从贵州某猪场肺组织中分离并保存。

1.1.2 主要试剂 AMV RTase,为上海生工生物工程技术服务有限公司产品;RNAiso Reagent、Taq酶等PCR试剂、PstI和EcoR I内切酶、pMD-18T载体为宝生物工程(大连)有限公司;胶回收试剂盒,为Omega公司产品;质粒提取试剂盒为博大泰恒公司产品;E.coliDH5α感受态细胞由本实验室制备保存。

1.2 方法

1.2.1 蚊蝇样本PRRSV阳性筛选 分别取每个猪场内30只蚊蝇样本先在生理盐水中漂洗1次～2次,加适量DEPC-H2O于无菌研钵中研磨,匀浆后反复冻融,12 00 0r/min(4℃)离心10 min,取上清液采用T rizol法提取总 RNA样本。以针对PRRSV N 基因 的引 物 (N1:5′-AATATGCCAAATAACAACGG -3′;N2:5′-CTACATGCTGAGGGTGATGC-3′)对家蝇RNA样本进行RT-PCR扩增。

1.2.2 PRRSV-NSP2基因克隆与测序 取PRRSV-N基因检测为阳性的猪场蚊蝇每场30只,采用 TrizoL法提取总 RNA样本,针对 PRRSVNSP2 基因引物(P1:5′-CGATGATGGCTTGAGCTGAGTAT-3′; P2: 5′-GGAGGCACCACGTTGTT TTCAAC-3′)进行 RT-PCR 扩增,胶回收试剂盒回收扩增产物,送宝生物工程(大连)有限公司测序,将检测出的3株(HXHX、BJKB、WDZY)蚊蝇样本的PRRSV NSP2基因的核苷酸测序结果与猪源PRRSV(CH-1a 、CH-1R 、GZJS 、GZKB、GZWB、HB-2、HUN-4、HXKB 、JXA1、VR2332、YUNI)株 NSP2基因的核苷酸进行同源性分析。

2 结果

2.1 PRRSV-N基因的RT-PCR扩增结果

用Trizol法提取猪场蚊蝇样本总 RNA,针对PRRSV-N基因,进行 RT-PCR检测,经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳分析,结果见图1。

从图1可知,花溪、乌当、毕节3个猪场蚊蝇待检样本均扩增出大小约372 bp的片段,与阳性对照的片段大小一致 ,而贵阳(康宝)和六盘水2个猪场的蚊蝇样本未扩增出预期片段。

2.2 PRRSV-NSP2基因的克隆与序列分析

2.2.1 PRRSV-NSP2基因的RT-PCR扩增 针对PRRSV-NSP2基因,对PRRSV-N基因检测为阳性的蚊蝇样本进行RT-PCR扩增,经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳分析,结果见图2。

从图2可以看出,花溪、乌当、毕节3个猪场蚊蝇待检样本扩增出大小约为1 064 bp的片段,与阳性对照的片段大小一致。

2.2.2 重组质粒的鉴定 回收目的DNA片段,连接到pMD-18T载体上,转化DH5α感受态细胞上,经蓝白斑筛选后,提取重组质粒 DNA,采用PRRSV-NSP2基因引物进行PCR扩增,扩增结果均可见到特异性的DNA条带(图3)。以限制性内切酶EcoRⅠ和PsTⅠ对重组质粒进行双酶切,经琼脂糖凝胶电泳分析后,均能见到约为1 156 bp和2640 bp的2条DNA片段(图 4),与理论推断的DNA片段大小基本一致。

图1 PRRSV-N基因对贵州省5个猪场蚊蝇样本的RT-PCR检测结果Fig.1 The RT-PCR results amplified by PRRSV N gene primers to the flies and mosquitoes from five farms in Guizhou

图2 PRRSV-NSP2基因对3个阳性蚊蝇样本的RT-PCR检测结果Fig.2 The RT-PCR results amplified by P RRSV NSP2 gene primers to the three positive samples of flies and mosquitoes

图3 PRRSV-NSP2基因重组质粒DNA的PCR鉴定结果Fig.3 PCR amplification of PRRSV-NSP2 gene recombinant plasmid

图4 重组质粒的双酶切鉴定结果Fig.4 The results of recombinant plasmid double digestion identification

2.2.3 NSP2核苷酸序列及同源性比较

应用DNA Star软件进行序列比对,3株贵州省蚊蝇样本的PRRSV-NSP2基因的核苷酸测序结果之间存在较高的同源性,可达97.9%～98.3%;蚊蝇样本的 PRRSV-NSP2基因片段与贵州猪场猪源PRRSV流行株相比具有较高的核苷酸同源性,高达97.6%～100.0%,与国内最近流行变异毒株的核苷酸同源性为84.3%～98.8%,而与早期国内外分离经典毒株的核苷酸同源性为77.1%～97.7%(表1)。

表1 蚊蝇与猪场猪源PRRSV NSP2基因核苷酸序列同源性比较Table 1 Comparision of the nucleotide homology of PRRSV NSP2 between indigenous flies,mosquitoes and swine

3 讨论

猪繁殖与呼吸综合征是严重影响中国养猪业发展的一大疫病,严重损害了广大农民和各地区养殖场的经济效益。高致病性猪繁殖与呼吸综合征的发生,除与基因变异致使病毒的毒力增强有关外,也与其传播途径密切相关,如感染猪、精液、污染用具、出入车辆、空气以及虫媒等,均能传播该病毒[2-3,6]。2006年6月我国南方部分地区(江西、湖北、湖南、安徽等)在高温高湿季节突发高致病性、高死亡率的猪“高热病”,经多方面实验证实该“高热病”主要病原为高致病性PRRSV,与经典PRRSV株存在一定的变异。猪繁殖与呼吸综合征多发于每年的4月～10月份,而此时间段正是蚊蝇等昆虫孳生的最佳时期。史开志等[8]报道三带喙库蚊体内也能携带PRRSV,因此,本研究通过调查蚊蝇体内能否检测到PRRSV,采用分子生物学和生物信息学技术对贵州省猪场蚊蝇PRRSV变异情况进行了分析,进而证实来源于猪场的蚊蝇样本中确实携带PRRSV,并且与一些流行株和传统株存在一定的变异性,本研究结果对该病的防控具有着重要意义。

本研究通过采集贵州省5个猪场蚊蝇样本,通过RT-PCR方法检测PRRSV核酸,结果显示,3家猪场采集的蚊蝇样本PRRSV检测为阳性,这可能与这些猪场一直存在PRRSV的持续性感染有关,蚊蝇是否能垂直传播PRRSV,尚需进一步研究。

由于时间、条件等原因,蚊蝇是否通过垂直传播感染卵从而传播PRRSV,PRRSV在蚊蝇体内中是否导致突变,这些突变是否改变病毒的抗原性,以及突变后的病毒在毒力和致病力等方面是否发生改变,还需要进一步研究。

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Investigation on Mosquitoes and Flies Carrying PRRSV in Five Pig Farms of Guizhou

LU Xian-li1,ZHOU Bi-jun1,2,WANG Kai-gong1,2,WEN Ming1,2,CHENG Zhen-tao1,2,LUO Yi1,JIANG Nan1

(Guizhou University,College of Animal Science,Guiyang,Guizhou,550025,China;
2.Laboratory of Animal Disease in Guizhou Province,Guiyang,Guizhou,550025,China)

In order to detect porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)in mosquitoes and flies,the mosquitoes and flies in five pig farms of Guizhu were selected.RT-PCRwas used to clone the PRRSV NSP2 gene,and the sequsences was analyzed.The resultes indicated that the length of the PRRSV N gene fragment in the mosquitoes and flies is 372 bp in three pig farms named Huaxi,Wudang,Bijie.The homology of PRRSV NSP2 gene in the three samples of mosquito and flies is up to 97.9%-98.3%,the homology of PRRSV NSP2 gene segments between samples and Guizhou swine PRRSV strains is up to 97.6%-100.0%,the homology between samples and recently popular variant strains of domestic is up to 84.3%-98.8%,the homology between samples and classical strains isolated is up to 77.1%-97.7%.Experimental results showed that mosquitoes and flies collected from some pig farms in Guizhou carried porcine reproductive and respiratory syndrome virus.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus;mosquitos;fliy;cloning and sequence analysis

S852.659.6

A

1007-5038(2011)09-0030-04

2011-06-16

国家自然科学基金项目(31072158);贵州省农业攻关项目[黔科合 NY字(2009)3071号];贵州省农业委员会科技计划项目(2010-11)

路宪礼(1984-),男,河南商丘人,硕士研究生,主要从事兽医微生物学与免疫学研究。