生物技术药物的剂型研究进展

贾 阳，谢予朋，靳英华

(中国人民解放军北京军区总医院药剂科，北京 100700)

生物技术药物是指利用生物技术手段生产或获得的药物，包括基因工程药物和基因药物。目前除生物芯片及基因检测领域由于实际投资较晚且正处于前期研发阶段，尚未实现净收益外，其他生物技术领域均已实现净收益，其中基因工程药物领域累计实现的净收益最高，在整个生物领域占到63% 的市场份额。传统的药物主要是化学小分子，生物利用度较好，而现代的基因药物和蛋白质药物大多数是生物大分子，穿透能力低。因此，随着生物技术药物的发展，其剂型研究迫在眉睫。

1 基因工程药物的剂型研究

1.1 概述

基因工程药物是指采用现代生物技术(如采用DNA重组技术或其他生物新技术)借助某些微生物、植物或动物来生产所需的药品。目前临床使用的基因工程药物的主要剂型均为溶液型注射剂和冻干粉针剂，因其为生物蛋白，体内极易被蛋白酶降解，故需反复注射给药，给临床带来了不方便。对基因工程药物进行剂型改造，现阶段普遍采用生物可降解高分子材料对药物进行包裹，以增强其稳定性并达到控释缓释的效果[1]，另外还可将材料进行靶向性修饰而使药物具有靶向性。

1.2 纳米脂质体、纳米囊、纳米球和共聚物材料

纳米脂质体、纳米囊、纳米球通常由聚乳酸、聚丙交酯－乙交酯、壳聚糖、明胶等生物可降解高分子材料包裹药物，可形成各种粒径不超过100 nm的胶束，其具有纳米材料的特性。生物可降解材料可以用于口服、静脉注射和肌肉注射，非生物可降解材料只能用于口服。聚合物胶束是近几年正在发展的一类新型纳米载体。构成嵌段共聚物亲水区的主要是聚乙二醇，疏水区常用聚氧乙烯、聚苯乙烯、聚氨基酸及聚己内酯等聚酯类，它们与聚乙二醇一起构成两性聚合物。

1.3 海绵体外用剂型

近年有人以Ⅰ型胶原蛋白、酸性成纤维细胞生长因子(acid fibro－blast growth factor，aFGF)为主要原料制备酸性成纤维细胞生长因子复合胶原海绵体[2]。将aFGF配制成50 μg/mL的溶液，过滤除菌;将制备的Ⅰ型胶原蛋白溶液用0.05 mol/L的NaH溶液调pH至6，然后与aFGF溶液按照1∶1体积比混合，倒入模具中，经过冷冻干燥成海绵体，即得aFGF胶原海绵。再进行生物安全性评价试验，包括急性毒性试验、刺激性试验、致敏试验、溶血性试验、细胞毒性试验以及动物体内埋植试验，结果证明，aFGF胶原海绵的毒理学试验结果均呈阴性，在兔肝埋植试验中未见异常反应，8周内降解;在临床上选取开放性创面进行贴敷，证明临床应用具有促进创面愈合、阻止渗液溢出的效果。

2 基因药物的药物递送系统研究

2.1 概述

基因药物是将治疗基因接到病毒或非病毒性载体中输入体内进行治疗的药物。基因药物的研究是针对功能基因组和基因转录本mRNA两类生物大分子中人体异常表达的致病基因，以及外源致病微生物基因进行基因治疗。基因核酸药物制剂研究开始于20世纪70年代中期，从第一个反义核酸药物Vitrovene于1998年和1999年相继在美国和欧洲上市[3]以来，目前全球已有近30个药物和治疗方案进入临床试验。

Verma[4]强调，基因治疗的关键在于基因递送系统。目前，广泛使用的基因递送系统可分为病毒与非病毒基因递送系统。病毒基因递送系统的转染率高，但存在野生型感染，尤其是最近发生的基因治疗致患者死亡事件，使得人们对病毒基因递送系统的选择更加慎重。因此，非病毒基因递送系统是未来的发展方向。但一般非病毒载体转染效率低，因为基因药物分子量大且表面带负电、亲水性过强而不易通过细胞膜[5]，且易被核酸酶降解。开发稳定的、具有一定亲水亲油平衡、透过性好，尤其是直接靶向的非病毒基因药物载体，对于改善基因药物治疗尤为关键。

2.2 受体介导靶向性非病毒基因递送系统

常见用于靶向的配体及其靶向的特异性细胞对应关系见表1。受体靶向的机制是基因通过受体介导的内吞途径(receptor mediated endocytosis)进入细胞。其中去唾液酸糖蛋白受体具有高亲和力，因此对非病毒载体的糖基化修饰在基因靶向治疗中研究较多，最具有开发前景。

表1 常见用于靶向的配体及其靶向的特异性细胞

1)糖基化修饰的阳离子脂质体基因递送系统

阳离子脂质体通常由1个单一的阳离子两亲化合物和1个中性辅助脂组成，前者又称为细胞转染素(cytofectin)，是阳离子脂质体的活性中心和关键部位。细胞转染素的基本结构是1个带正电荷的头基团(亲水基团)连接在1个疏水基团上，头基团一般是带有1个或数个氨基的长链胺类基团，疏水基团则主要有脂肪酰链和胆固醇环两类。中性或兼性辅助脂(colipid)与之结合的目的是稳定双层膜和降低阳性成分的毒性，其中二油酰磷脂酰乙醇胺是应用最广的中性磷脂。Hara等[6]报道，去唾液酸脂球蛋白质修饰的脂质体DNA复合物，可通过去唾液酸糖蛋白受体介导的内吞途径被体外培养的肝实质细胞摄取。采用预先给予乙二胺四乙酸和门静脉注射给药的方法，基因表达在肝脏中最强。

由于在阳离子脂质体中引入去唾液酸糖蛋白非常烦琐，用低相对分子质量的糖基(半乳糖基)修饰，方法简单且减少了免疫原性，具有更大的优势。Mitsuru等[7]在此基础上合成了一系列新型胆固醇衍生物。此类衍生物带有正电荷，可与DNA结合，半乳糖基或甘露糖基可通过去唾液酸糖蛋白受体或甘露糖受体靶向于肝实质细胞或肝巨噬细胞。由于肺部第一毛细血管床(the first capihary bed)的截留效应，未被糖基修饰的脂质体主要在肺部被非目的组织摄取，而糖基化修饰的上述脂质体可通过受体介导的内吞途径在肝实质细胞或巨噬细胞中均具有较高的摄取率及转染活性，且对细胞的毒性较低。

2)糖基化修饰的阳离子聚氨基酸基因递送系统

目前聚赖氨酸(poly－lysine，PLL)被广泛用作载体的骨架。阳离子聚赖氨酸与带负电的成分通过静电结合(降低DNA负电性的同时携带其透膜)形成复合物后，进行糖基化修饰，即能进行受体介导的靶向性治疗。肿瘤细胞表面的内皮生长因子受体(EGFR)、转铁蛋白受体、叶酸受体均过度表达[8－9]，因此可通过采用上述合适的配体对非病毒基因递送系统进行修饰，以实现肿瘤细胞的靶向治疗。如聚赖氨酸与内皮生长因子受体特异性抗体通过化学键结合可形成用于肿瘤基因治疗的靶向性载体[10]。

3)糖基化壳聚糖基因递送系统

壳聚糖是甲壳类动物中的甲壳素脱乙酰化后得到的多糖类物质，作为基因给药系统的最大特点是安全性高、无免疫原性、生物可降解。通过对壳聚糖进行糖基化修饰，可提高其转染效率。壳聚糖的相对分子质量会影响粒子的大小、复合物的稳定性和转染率。当壳聚糖的相对分子质量为40 000时，复合物的转染率较高。

4)含有核定位信号的非病毒基因递送系统

基因药物经过膜受体介导、靶向内吞进入细胞质后，最终目的是要进入细胞核进行基因表达调控的校正，从而达到治疗目的。细胞处于静止状态时，核膜是基因入核的主要屏障。核孔复合物的孔径一般为9 nm，相对分子质量小于20 000～40 000或粒径小于9 nm的物质可通过被动扩散进入核内，而大分子如基因则要通过核孔复合物(nuclear proe complexes)主动转运入核内。在核定位信号(nuclear localization signals)介导的主动转运过程中，核孔复合物的孔径可增加到26 nm[11]。值得注意的是，将核定位信号与非病毒载体如聚赖氨酸连接并不能提高基因的转染效率，说明核定位信号的作用在胞内而非细胞膜表面。Tachibana等[12]通过增加核定位信号，已成功地将牛血清白蛋白靶向于细胞核。

2.3 受体介导靶向性非病毒基因递送系统阳离子电荷屏蔽修饰

上述非病毒基因载体使用阳离子载体过量形成表面带正电荷的复合物，在血液中可引起非特异性的清除和毒副作用，因此对载体表面阳离子进行电荷屏蔽也显得十分重要。现研究最多的、效果最好的是以聚乙二醇进行的修饰。聚乙二醇为一电荷中性多聚物，用其对DNA/靶向性配体修饰的载体复合物进行结构修饰，可降低或屏蔽复合物所带的电荷性。其制备的最佳方法为，先将靶向性配体修饰结合聚乙二醇，然后将聚乙二醇与所选用的非病毒载体进行共价结合，形成配基－聚乙二醇－载体复合物，最后与DNA浓缩形成复合物。该方法较其他方法可更快速、更容易地形成聚乙二醇修饰的DNA复合物[13]。

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