miR-605和miR-149基因多态性以及相关因素与肺癌易感性的关联研究

张明五，余运贤，金明娟，潘益峰，姜 侠，李其龙，马新源，张善春，陈 坤

1.浙江大学公共卫生学院流行病学与卫生统计学系，浙江 杭州 310058;2.浙江省嘉善县肿瘤防治所，浙江 嘉善 314100)

监测数据表明，上海在上世纪80年代初期肺癌发病率接近日本［1］，在2000年 －2004年期间，上海市女性肺癌的粗发病率为33.73/10万，标化发病率为30.90/10万，男性的粗发病率和标化发病率则分别为81.65/10万和33.73/10 万［2］，接近西方国家［3］。肺癌发病率增加与环境污染等因素密切相关，同时吸烟也是导致肺癌发病率不断上升的重要因素之一。就目前而言，确定肺癌相关的危险或保护因素，筛选合适的易感性分子标志物，对于肺癌的早期预警和预防有重要价值和意义。

microRNAs(miRNA)是一类大小约21－23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70－90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。这些非编码小分子RNA(miRNA)参与调控基因表达，miRNA通过与靶基因的mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译［4-5］。研究表明在一些miRNA的编码基因区域存在多态性位点，这些位点可能会对miRNA表达或剪切、成熟过程产生影响，进而影响其对靶基因的调控效应［6］。

研究表明，位于miR-196a2的多态性位点与肺癌的发病风险增加显著相关［7］，而且该位点与肺癌的预后也密切相关［8］。在K-ras的3'端非编码区域的let-7结合位点的SNP位点也与肺癌的发病风险改变有关［9］，这些研究从另外一个侧面证实了miRNA在肺癌发生发展中的作用。本研究试图探讨miR-605(rs2043556)和miR-149(rs2292832)这2个多态性位点与肺癌发病风险的关系;通过检索miRNA多态性位点数据库(http://www.patrocles.org/)，未见有关miR-605(rs2043556)和miR-149(rs2292832)2个多态性位点与肺癌易感性进行研究的报道。

1 材料方法

1.1 研究对象 采用以人群为基础的病例对照研究［10］。本研究纳入了2002年－2008年期间在浙江省嘉善县肿瘤研究所报告的244例肺癌病例，病例纳入要符合以下标准:①为嘉善县的本地常住居民;②经确诊为肺癌患者;③未接受过放疗及化疗。对照的选择方法:以年龄(±5岁)、性别和居住地为匹配因素，从同一时期的自然人群对照库中随机抽取。所有的研究对象都签署了知情同意书。采用问卷调查的方式获取研究对象的基本资料和吸烟、饮酒、喝茶以及性格特征等相关信息。

1.2 标本的收集和处理 采集研究对象外周静脉血5ml，枸橼酸钠抗凝，低温冻存;参考试剂盒说明书，DNA分离纯化试剂盒(北京天根生化科技有限公司)分离纯化淋巴细胞DNA;采用核酸定量仪(德国Eppendorf公司)检测其浓度和纯度，调整DNA终质量浓度为100 ng/μl，置低温冰箱冻存。

1.3 候选基因和SNP位点的选择 鉴于目前对miRNA功能的研究和报道比较有限，在miRNA 数据库(http://www.mirbase.org/)中检索拟定研究miRNA的靶基因，结合文献报道对其可能的功能或调控机制的确认，选择可能与肿瘤发生、发展相关的多态性位点。同时，在miRNA多态性位点数据库(http://www.patrocles.org/)选择多态性位点在中国人群中的突变频率 ＞0.05;最后选择了 miR-605(rs2043556)和miR-149(rs2292832)2个多态位点。

1.4 基因型检测 采用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-Restrictedfragmentslength polymorphism，RFLP)技术检测miR-605(rs2043556)和miR-149(rs2292832)基因多态性位点的基因型。在检测过程中，随机抽取5%的样品进行重复检测，2次检测结果的一致率为99%以上。

1.5 统计学分析 研究中采用SPSS 14.0统计软件对数据进行分析处理;其中年龄为连续变量，采用t检验对病例组和对照组的分布进行比较;体重指数(body mass index，BMI)转化为(≤24和＞24)分类变量后和性别、职业等因素，采用χ2检验对其分布特征进行比较;采用多因素logistic回归分析吸烟与肺癌发病风险的关系时，年龄、性别、BMI、职业作为协变量，而在分析多态性位点与肺癌发病风险的关系时，以上提到的协变量加上吸烟、饮酒、饮茶、是否容易生气作为协变量纳入方程进行分析;同时，以性别和吸烟作为分层变量，探讨它们与基因之间对肺癌易感性的交互作用。统计分析均采用双侧检验，以α=0.05作为统计学显著性水平的判断标准。

2 结果

2.1 研究对象的基本人口学特征 表1显示，病例组和对照组在年龄、性别、职业、BMI和教育程度等特征方面，差异均无统计学意义(P＞0.05);但是，病例组的吸烟率(64.8%)明显高于对照组(51.9%，P＜0.01)。

2.2 吸烟与肺癌发病风险的关系 在校正了年龄、性别、职业、BMI后，采用非条件Logistic对行为习惯因素进行分析，结果表明，每天吸烟＜20支者肺癌的发病风险是不吸烟者的1.7倍(OR=1.7，95%CI:1.0－3.0);每天吸烟20支及以上者的发病风险增加到4.2倍(OR=4.2，95%CI:2.3 －7.6);饮酒、容易生气、喝茶等因素与肺癌的发病风险之间无统计学关联(表2)。

2.3 miR-149和miR-605多态性与肺癌易感性的关系 表3显示，在校正了年龄、性别、BMI、职业、吸烟、饮酒、饮茶和容易生气后，与miR-605 AA基因型携带者相比，AG和GG携带者的OR分别为1.2(95%CI:0.4－3.4)和1.7(95%CI:0.6－4.8)。将AG和GG基因型合并后，即至少1个G等位基因携带者的OR=1.2(95%CI:0.8－1.7)，关联均无统计学意义(P＞0.05)。与miR-149 TT基因型携带者相比，CT和TT携带者的OR分别为0.7(95%CI:0.3－2.2)和0.6(95%CI:0.2－1.9)，而至少1个C等位基因型携带者的OR=0.9(95CI:0.6－1.3);以上关联均无统计学意义(P ＞0.05)。

2.4 性别和吸烟分层后miR-149和miR-605与肺癌的相关性 表4显示，在吸烟和不吸烟的人群中，miR-605至少1个G(AG+GG)等位基因携带者的OR分别为1.4(95%:0.9－2.3)和0.9(95%CI:0.5－1.7)，miR-149至少1个C(CT+CC)等位基因携带者的OR分别为0.8(95%CI:0.5－1.3)和1.1(95%CI:0.6－2.0)，关联均无统计学意义。

在男性人群中，与miR-605 AA基因型相比，至少1个G等位基因携带者的OR分别为1.5(95%CI:1.0－2.3)，P=0.071;而该基因型在女性人群中的OR=0.6(95%CI:0.3－1.4)，P=0.245。在男性人群中，与 miR-149 TT基因型携带者相比，至少1个C(CT+CC)等位基因携带者的OR=0.9(95%CI:0.6－1.4)和在女性人群中的OR=1.9(95%CI:0.4－1.9)，关联均无统计学意义。

表1 研究对象的基本特征Table 1 Distributions of socio-demographic variables among case and control groups

表2 行为习惯因素与肺癌发病风险的相关性Table 2 Associations of life-style related factors with lung cancer risk

表3 miR-605和miR-149基因多态性与肺癌易感性的关系Table 3 Associations of miR-605 and miR-149 polymorphisms with lung cancer risk

表4 按吸烟和性别分层后miR-149和miR-605多态性与肺癌易感性的关系Table 4 Adjusted associations of miR-149 and miR-605 polymorphisms with lung cancer risk after stratification by smoking and sex

3 讨论

肺癌是严重威胁人类健康的恶性疾病，寻找影响肺癌发生、发展的因素对实现肺癌的预防具有重要价值。本研究进一步证实吸烟会明显增加肺癌的发病风险，但没有发现miR-149多态性与肺癌的发病风险之间有统计学关联;但是，在男性人群中，miR-605突变与肺癌的发病风险存在一定的关联，提示该突变位点可能会增加男性肺癌的发病风险。另外，本研究没有发现吸烟与miR-605和miR-149之间有交互作用。

基于miRNA参与调控基因表达的分子机制，miRNA参与肿瘤易感性改变要满足2个基本条件:第一，该位点能改变miRNA的表达水平;第二，相关miRNA调控的靶基因与肿瘤的发生、发展密切相关。本课题组前期对肠黏膜组织的研究结果显示，该多态性位点与其成熟miRNA的表达水平有关，提示选择的这2个位点是有功能的位点。研究表明，miR-149*可以通过调控E2F1和Akt的表达诱导肿瘤细胞的凋亡，该研究证实E2F1和Akt是miR-149的靶基因［11］。而E2F1和 Akt在信号转导和细胞增殖、凋亡以及分化的调控过程中发挥重要的作用［12-13］。而本研究则发现，miR-149基因多态性与肺癌的发病风险之间没有统计学关联，与前期在中国人群的另一项研究结果相近［7］。提示miR-149的表达可能具有较强的组织特异性，对于该位点是否会影响miR-149的表达，而最终会影响到哪些基因的表达调控还有待进一步的研究。

研究发现，miR-605是P53调控网络的重要组成部分之一［14］。P53基因除了参与细胞增殖和凋亡调控外，还参与部分miRNAs的表达调控［15］，相互之间形成了有机的调控网络［16］。miR-605作为调控网络中的一个分子，其表达异常必然会影响肿瘤的发生和发展。但本研究没有发现miR-605编码基因多态性与肺癌的发病风险有关联，而关于miR-605在肺癌组织中的表达及其与肺癌的相关性还没有见到文献报道，具体的分子机制还有待研究。

本研究按照性别分层分析的结果表明，在男性人群中miR-605的突变基因型与肺癌发病风险的关联有临界的统计学意义，在女性人群中未发现类似的结果，提示该位点可能是男性的危险基因型。而结果未达到统计学的显著性水准可能与样本量不足有关，尤其是经过分层后，进行分析的样本量限制了统计分析的效率。

除了遗传因素外，个体行为习惯往往也是影响肿瘤发病风险的重要因素，本研究没有发现饮酒、喝茶和容易生气等与肺癌的发病风险有关联。而对吸烟行为习惯的分析结果与大量的研究结果类似，本研究表明吸烟频率增加是肺癌的重要危险因素，相对于不吸烟的人群，随着吸烟频率的增加，肺癌的发病风险将增加1－3倍。该研究结果提示，吸烟可能会导致遗传损伤的机会和概率增加，进而增加基因乃至细胞突变的机会和概率［17］。

但总体来说该研究还存在以下不足之处:首先样本量不足可能会对研究结果的稳定性产生重要影响;其次，在分析吸烟的危险时因为资料缺陷，没有分析吸烟的暴露总量对肺癌发病风险的影响;第三，本研究没有从组织水平对该多态性位点的功能性进行确认;第四，本研究采用病例对照研究，对照的选择可能不当，造成选择性偏倚。另外，本研究对象对吸烟等变量可能产生回忆性偏倚。以上这些不足都将会对本研究结果或结论产生影响。

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