XPC基因Lys939Gln和Ala499Val多态性与乳腺癌易感性的关联研究

吴茵茵，马新源，姚开颜，李其龙，陈 坤

(1.浙江大学公共卫生学院流行病学与卫生统计学系，浙江 杭州 310058;2.浙江省嘉善县肿瘤防治所，浙江 嘉善 314100)

据世界卫生组织(WHO)报道，2004年世界上恶性肿瘤居死亡谱的第3位。其中，在发达国家死亡谱前10位中，肺癌、结直肠癌、乳腺癌和胃癌分别占第3、7、9和10位。在我国，乳腺癌仍是影响女性健康的重要癌症之一。卫生部2004年颁发的《中国癌症预防与控制规划纲要(2004-2010)》也指出，我国恶性肿瘤的整体发病数呈明显的上升趋势。其中，结直肠癌、肺癌及乳腺癌等西方发达国家高发癌症在我国的发病迅速上升，与肝癌、食管癌、胃癌、宫颈癌和鼻咽癌等传统高发癌症并列为我国目前重点防治的8大恶性肿瘤。

乳腺癌的形成是个多阶段、多因素相互作用的过程。其中，遗传因素与环境因素被认为是起到关键作用的两大因素。DNA修复功能是机体内维持细胞遗传物质稳定性与完整性的重要机制，而着色性干皮病基因组C(xeroderma pigmentosum group C，XPC)在DNA修复中起着重要作用［1］。XPC基因的常见多态性位点有位于Exon15的Lys939Gln和Exon 4 Ala499Val等［2］。此前有研究提示，XPC的 Lys939Gln和Ala499Val多态性与多种恶性肿瘤的发病有关，如前列腺癌、食道癌及鼻咽癌等［3-5］。本研究采用以自然人群为基础的病例对照研究，分析XPC Lys939Gln和Ala499Val多态性与乳腺癌发病风险间的关系，并进一步分析基因与环境暴露因素的交互作用对乳腺癌发病风险的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究以浙江省嘉善县为研究现场，在2005年至2007年间，共收集了经病理组织学确诊的173例乳腺癌病例。同时，根据相同居住地和同年龄(±5岁)的原则按照1∶1配比原则进行健康对照的选择，共成功调查171例。研究对象总计344例。由经过统一培训的调查员采用统一编制的调查问卷，开展居民生活与健康的相关调查，内容包括一般情况、生活习惯、个人疾病史、家族肿瘤史与月经生育史等。

1.2 标本采集与基因组DNA抽提 问卷调查结束后，经研究对象知情同意，对每位调查对象采集5 ml外周静脉血，并采用改良盐析法进行外周血白细胞DNA的抽提。

1.3 SNPs基因分型 采用PCR-RFLP方法对XPC基因Lys 939Gln和Ala 499Val多态进行基因分型。其中，Lys939Gln的引物序列为5'-GGA GGTGGACTCTCTTCTGATG-3'(上游)和5'-TAG ATCCCAGCAGATGACC-3'(下游)，Ala499Val为5'-TAAGGACCCAAGCTTGCCCG-3'(上游)和5'-CCCACTTTTCCTCCTGCTCACAG-3'(下游)。PCR反应体系为20 μl，包括:模板 DNA 100～200 ng，引物 0.2 μmol/L，1 × PCR buffer，dNTP 200 μmol/L，MgCI22.0 mmol/L，TaqDNA 聚合酶0.5 U。PCR反应条件:94℃预变性 5 min，94℃变性30 s，55℃ (Lys939Gln)或 63℃(Ala499Val)退火30 s，72℃延伸 45 s，35 个循环后，72℃最后延伸5 min。Lys939Gln的PCR产物(765 bp)经限制性内切酶PvuⅡ，于37℃温育6 h后，经2%琼脂糖凝胶电泳分析基因型。Ala499Val的PCR产物(152 bp)经限制性内切酶SacⅡ，于37℃温育6 h后，经3%琼脂糖凝胶电泳分析基因型。Lys939Gln的纯合变异型经消化后产生582 bp和183 bp的产物。Ala499Val的野生型经消化后产生131 bp和21 bp的产物。实验所需引物和试剂为上海生工生物工程技术服务有限公司合成和购买。

1.4 统计分析 采用Pearson卡方检验或Mann-Whitney U检验对病例组和对照组基本特征的分布进行比较。采用卡方拟合优度检验对各SNP基因型在对照组中的分布是否符合Hardy-Weinberg(H-W)遗传平衡定律进行分析。采用比值比(odds ratio，OR)及其95%可信区间(confidential interval，CI)对各 SNP基因型的相对危险度进行估计。OR值以非条件Logistic回归模型计算，并经年龄、月经初潮年龄和绝经状态校正。采用叉生分析对基因-环境交互作用进行分析。以上统计分析均采用SAS version 9.0软件完成。采用Haploview软件对 XPC基因 SNPs进行连锁不平衡分析(Pairwise Linkage disequilibrium，LD)。采用基于R软件运行的统计模块 Haplo.stats包对XPC基因单体型进行预测分析，并计算经年龄、月经初潮年龄和绝经状态校正的OR值及其95%CI以评估其相对危险度。

2 结果

2.1 病例组与对照组基本特征因素分布的比较 由表1可知，病例组和对照组在年龄、5年前的体质指数(BMI)、婚姻状况、教育程度、职业、吸烟史、饮酒史、饮茶史、家族肿瘤史、经期规律、绝经状态、生育史、哺乳史、避孕史等因素上的分布无统计学差异(P＞0.05)。但病例组月经初潮年龄低于17岁者的比例要明显高于对照组(P=0.039)。此外，多因素Logistic回归模型还提示，绝经状态与乳腺癌发病风险间存在有统计学意义的关联，已绝经妇女乳腺癌的发病风险较未绝经妇女高(OR=2.76，95%CI=1.32 －5.80，P=0.007)。

2.2 XPC Lys939Gln和Ala499Val多态与乳腺癌的关系 本研究病例组1例XPC Lys939Gln扩增失败，对照组1例XPC Ala499Val扩增失败。由表2可知，病例组中，XPC Lys939Gln(A/C)的AA、AC和CC基因型的分布频率分别为44.8%、40.7%和14.5%，Ala499Val(C/T)的CC、CT和TT基因型的分布频率分别为37.6%、49.7%和 12.7%。对照组依次为39.2%、51.5% 和 9.4%，40.6%、50.0% 和9.4%。所有基因型在两组间的分布差异均无统计学意义(P＞0.05)。经年龄、月经初潮年龄与绝经状态的调整，所有基因型与乳腺癌发病风险间无统计学意义的关联(P＞0.05)。

表1 研究对象基本特征Table 1 Demographic characteristics of study population

特征 对照组(n=171)病例组(n=173)P值0.808是155(91.2)159(91.9)否15(8.8)14(8.1)痛经/n(%)0.829无132(77.6)136(78.6)有38(22.4)37(21.4)绝经/n(%)0.074否55(32.5)41(23.8)是114(67.5)131(76.2)生育史/n(%)0.569否1(0.6)2(1.2)是170(99.4)171(98.8)哺乳史/n(%)0.742否4(2.3)5(2.9)是167(97.7)167(97.1)避孕史/n(%)0.610否36(22.2)37(22.4)是126(77.8)128(77.6)月经周期正常/n(%)

2.3 XPC基因单体型与乳腺癌的关系 LD分析结果显示，XPC Lys939Gln与Ala499Val在对照组和病例组中均存在 LD(D'=0.922，r2=0.243;D'=0.747，r2=0.179)。单体型分析结果显示，CC、AT和AC是最常见的3类单体型，其在对照组中的分布频率分别为34.1%、33.6%和 31.3%，在病例组中为 31.5%、34.3%和30.9%。各单体型在病例组与对照组间的分布差异无统计学意义(P＞0.05)。经年龄、月经初潮年龄与绝经状态的调整，未发现单体型与乳腺癌发病风险间有统计学意义的关联(P ＞0.05，表2)。

2.4 基因-环境联合作用 经过年龄因素与绝经状况的调整，与携带Lys939Gln AC/CC基因型的月经初潮年龄≥17岁者相比，携带Lys939Gln AA基因型的月经初潮年龄＜17岁者患乳腺癌的发病风险显著上升(OR=2.3，95%CI=1.2－4.5，P=0.011)。但两者间不存在有统计学意义的交互作用(P=0.754)。而经过年龄因素与月经初潮年龄的调整，与携带Lys939Gln AC/CC基因型的未绝经妇女相比，携带Lys939Gln AA基因型的未绝经妇女、携带Lys939Gln AC/CC基因型的已绝经妇女及携带Lys939Gln AA基因型的已绝经妇女，其患乳腺癌的发病风险均显著上升(OR=2.8，95%CI=1.2 －6.7;OR=3.3，95%CI=1.5 －7.3，P=0.003;OR=3.6，95%CI=1.6 －8.2，P=0.002)，且两者的交互作用有统计学意义(P=0.032，表3)。

表2 XPC Lys939Gln和Ala499Val单核苷酸多态性及单体型与乳腺癌发病风险的相关性Table 2 The adjusted associations of XPC genotype and haplotype with breast cancer risk

表3 XPC Lys939Gln和Ala499Val与女性生理相关因素的交互作用对乳腺癌发病风险的影响Table 3 Gene-environment interaction on breast cancer risk

aOR:比值比，模型校正了年龄、初潮年龄和是否绝经等变量;bCI:置信区间;cP for interaction，交互作用的P值.

3 讨论

XPC基因位于人3号染色体(3p25)，由15个外显子组成，大小约17 kb。其编码的蛋白质主要存在于细胞核中。研究发现，XPC基因的编码产物与HR23B形成XPC-HR23B复合物，参与DNA损伤识别和核苷酸切除修复的启动［6-7］。

本研究通过对173例病例和171例对照进行基因分型检测发现，对照组 Lys939Gln的AA、AC和CC基因型分布频率分别为39.2%、51.5%和9.4%，Ala499Val的 CC、CT 和 TT 基因型分布频率分别为40.6%、50.0%和9.4%，均符合H-W遗传平衡定律。在经过年龄、月经初潮年龄及绝经状态的调整后，XPC所有基因型与乳腺癌发病风险间均未发现有统计学意义的关联。以往研究［8-12］也未发现Lys939Gln和Ala499Val与乳腺癌发病间有统计学意义的关联。但Zhang等通过一项基于医院的病例对照研究［13］，对220例乳腺癌病例和310例对照进行Lys939Gln的基因型检测，发现与Lys939Gln的AA基因型相比，Lys939Gln AC基因型显著增加了乳腺癌的发病风险(OR=1.5;95%CI=1.0～2.2)，而CC基因型降低了乳腺癌的发病风险(OR=0.9;95%CI=0.5 ～1.7)。本研究关于Lys939Gln基因型与乳腺癌发病风险间关联的结果与其不一致，推测可能的原因为:本研究的对照是基于人群的健康对照，Zhang等的研究是基于医院开展的病例对照研究，且对照中有部分是非乳腺癌患者，因此可能存在一定的样本偏倚，从而影响其对Lys939Gln多态与乳腺癌发病风险间真实关联的判断。但是，本研究的样本量偏小，这在一定程度上也影响了本研究结果对基因多态与乳腺癌发病风险间关联的解释。

本研究还对XPC基因进行了单体型分析，发现Lys939Gln与Ala499Val多态在病例组和对照组间存在连锁不平衡现象。以往研究对XPC基因Lys939Gln与Ala499Val多态进行单体型分析的较少，仅Shen等报道了单体型分析的结果［9］。与其研究结果一致，本研究发现CC、AT和AC(Lys939Gln-Ala499Val)是最常见的3类单体型，但未发现单体型与乳腺癌发病风险间有统计学意义的关联。

此外，目前大部分研究均认为，在肿瘤的发生、发展过程中，遗传因素与环境因素间可能存在一定的联合作用。以往的研究［8-9，11，13］也对Lys939Gln和Ala499Val与环境因素的联合作用进行分析，但未发现任何有统计学意义的结果。本研究通过对基因-环境的联合作用进行叉生分析，发现Lys939Gln与绝经状态间存在有统计学意义的交互作用(P=0.032)，与携带Lys939Gln AC/CC基因型的未绝经妇女相比，携带Lys939Gln AA基因型的未绝经妇女、携带Lys939Gln AC/CC基因型的已绝经妇女及携带Lys939Gln AA基因型的已绝经妇女，其患乳腺癌的发病风险均显著上升(OR=2.8，95%CI=1.2 －6.7;OR=3.3，95%CI=1.5 －7.3;OR=3.6，95%CI=1.6 －8.2)。

综上，本研究以浙江省嘉善县自然人群为基础开展的1∶1匹配的病例对照研究表明，XPC Lys939Gln和Ala499Val多态及其单体型与乳腺癌的发病风险间没有关联。对基因-环境的交互作用分析表明，Lys939Gln与绝经状态存在有统计学意义的交互作用。本研究的结果尚需更大样本的流行病学研究予以验证。

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