CASP3基因多态及单体型分布与乳腺癌危险性的关联研究

倪 勤，刘 冰，金明娟，马新源，姚开颜，李其龙，陈 坤

(1.浙江大学公共卫生学院流行病学与卫生统计学系，浙江 杭州 310058;2.浙江省嘉善县肿瘤防治所，浙江 嘉善 314100)

乳腺癌是世界上女性最高发的恶性肿瘤。少见的高外显基因BRCA1、BRCA2为乳腺癌的易感基因，但是只有约5% ～10%的乳腺癌发生归因于这些易感基因的突变［1］。因而，人群中更为普遍的、低外显率的弱易感基因可能与内源性危险因素、不良生活方式共同作用，对散发性乳腺癌的形成起到促进作用。

Caspase级联凋亡通路中的效应子有CASP3、CASP6和 CASP7，其中 CASP3是最重要的凋亡效应子，与DNA断裂、染色质凝聚和凋亡小体形成有关。而CASP6和CASP7即使被大量消耗，对凋亡级联反应的影响也相当微小［2］。CASP3基因定位于 4q35.1 区，编码的前体蛋白含有277个氨基酸，分子量约32 kD。CASP3前体蛋白在活化过程中从Asp28～Ser29和Asp175～Ser176两处被剪切，形成P17(29～175)和P10(182～277)两个片段，两种亚基再组成活性形式的CASP3，随后则可进行下一步的自我催化。国外文献报道，CASP3基因多态与肺癌、卵巢癌、非霍奇金淋巴瘤发病密切相关［3-8］，但是与乳腺癌易感性的相关研究尚未见报道。为了较全面地分析CASP3基因多态性与乳腺癌的易感性关联，本研究采用Tag SNP的方法选择单核苷酸多态性位点，以提高关联分析的有效性。

1 材料和方法

1.1 研究对象 本研究以浙江省嘉善县为研究现场，采用1∶1匹配的病例对照研究设计。乳腺癌病例均来自2005年5月-2008年5月在浙江嘉善县开展的现场病例。根据当地恶性肿瘤登记报告记录，251例乳腺癌均经病理组织学确诊。同时，按每个病例同居住地和同年龄(±5岁)的原则，选取健康对照者。研究对象共502例，均为女性，且是嘉善永久居民，由统一培训的调查员上门进行问卷调查。

1.2 血样采集及基因组DNA的提取 经研究对象知情同意后，每一个体采集静脉血5 ml，2 ml装入带有0.2 ml枸橼酸钠的真空小试管，3 ml装入无抗凝试剂的真空试管，放入-20℃冰箱保存。储存样品于1周内送回浙江大学医学院，取枸橼酸钠抗凝血1 ml，以RelaxGene血液基因组DNA抽提试剂盒(Tiangen生化科技，北京，中国)抽提全血基因组DNA后，于-20℃冰箱储存待检。

1.3 TagSNP的选取 根据 Hapmap数据库(http://www.hapmap.org)中 CHB(Chinese Han origin in Beijing，中国汉族)数据，运用Haploview软件进行TagSNP的选择。TagSNP的选取原则:①SNP位于CASP3基因区域内;②MAF＞0.05;③TagSNP能代表1个以上的SNP，且 r2＞0.8。共选取 3 个 TagSNPs，分别为rs4647693、rs2696056 和 rs4647610。

1.4 基因型检测 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)的方法对所有研究对象进行基因型的检测。本研究使用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，然后在BLAST数据库中评价引物的特异性，最后在Oligo 6.0软件中分析引物对的二级结构，选取最优引物以保证实验能高效进行。rs4647693位点的上下游引物分别为5'-AATTCTGTTGCCACCTTTCG-3'和5'-ACCTTCTGCGTGTTTGCTC-3';rs2696056位点的上下游引物分别为5'-TTTCCACCAC CACTCTGATA-3'和 5'-ATTATGGCTGTTTCC CTTTT-3';rs4647610位点的上下游引物分别为5'-AACCGCTTGAAGAAATCCTG-3'和5'-ATC TGCCTTGTTGAGCCACT-3'。所有引物均由上海生物工程公司合成。PCR反应体系均为20 μl，包括 10 × PCR buffer 2 μl，25 mmol/L MgCl21.6 μl，2 mmol/L dNTPs 2 μl，DMSO 1 μl，10 μmol/L 引物各 0.2 μl，Taq DNA 聚合酶 0.5 U，约 50 ng 基因组 DNA 0.5 μl，由双蒸水稀释至 20 μl。扩增条件为:94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，在各位点退火温度(rs4647693:56℃、rs2696056:52℃、rs4647610:57℃)退火30 s，72℃延伸30 s，循环34次，最后72℃延伸5 min。使用的仪器为PTC-200型PCR扩增仪(Bio-Rad，USA)。

PCR扩增后产物进行酶切分型。酶切总反应体系为 8 μl，包括 10×反应缓冲液 0.8 μl，10 U/μl限制性内切酶 0.3 μl，双蒸水 1.9 μl，PCR 扩增产物 5.0 μl。酶切产物经 37℃ 水浴6 h后，在2.5%的琼脂糖凝胶中电泳约20 min，然后在凝胶成像系统中观察电泳结果并进行基因型的判定。限制性内切酶Alw26l识别rs4647693多态位点，AA基因型产生443 bp 1个片段，AG 基因型产生443、246、197 bp 3个片段，GG基因型产生246、197 bp 2个片段;限制性内切酶DdeI识别rs2696056多态位点，GG基因型产生139 bp 1个片段，GC基因型产生139、105、34 bp 3 个片段，CC 基因型产生 105、34 bp 2个片段;限制性内切酶 HinfI识别rs4647610多态位点，AA基因型产生230 bp 1个片段，AG基因型产生230、178、52 bp 3个片段，GG基因型产生178、52 bp 2个片段(图1～图3)。

1.5 统计学方法 采用似然比χ2检验对照组中的基因型分布进行Hardy-Weinberg(H-W)平衡分析;分类变量和连续性变量在乳腺癌组和对照组中的分布比较分别采用Pearson χ2检验和Student-t检验;采用非条件logistic回归模型计算表示相对危险度的比值比(odds ratio，OR)及其95%可信区间(confidential interval，CI)，并以年龄、生活方式因素和生理生育因素进行校正;采用PHASE软件对CASP3单体型进行评估和计算;以P＜0.05为差异有统计学意义。以上统计分析均在SPSS 16.0 for Windows中进行。

2 结果

2.1 一般情况分析 乳腺癌组年龄为(54.87±11.20)岁，对照组年龄为(54.88 ± 11.46)岁，经t检验显示两组间年龄分布差异无统计学意义(P＞0.05)。以对照组初潮年龄中位数(16岁)分组，两组间初潮年龄分布差异有统计学意义(P=0.007);以对照组初孕年龄中位数(24岁)分组，两组间分布有统计学差异(P=0.002);以对照组末孕年龄中位数29岁分组，未发现两组间分布有统计学差异。其余吸烟、饮酒、饮茶、女性生理生育因素在两组间的频率分布均无统计学差异(表1)。

表1 研究对象的一般情况Table 1 The distribution of demographic characteristics among cases and controls

2.2 CASP3基因型频率分布及危险度分析对照组中CASP3和CASP9的基因型频率分布均符合 Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，说明具有较好的人群代表性。由表2可见，CASP3基因rs4647693多态性的GG、AG、AA 3种基因型在乳腺癌组中的频率分布分别为67.87%、28.11%和4.02%;在对照组中的频率分布分别为 63.16%、29.96% 和 6.88%;rs2696056 GG、GC、CC 3种基因型在乳腺癌组中的频率分布分别为 80.00%、19.60% 和 0.40%;在对照组中的频率分布分别为82.73%、16.47%和0.80%;rs4647610 AA、AG、GG 3 种基因型在乳腺癌组中的频率分布分别为51.41%、38.15%和10.44%;在对照组中的频率分布分别为51.82%、37.25% 和 10.93%;经 χ2检验均无统计学差异(P＞0.05)。经过年龄、吸烟、饮酒等因素调整后，未发现CAPSP33 个SNP与乳腺癌发病风险间存在有统计学意义的相关。

表2 CASP3 TagSNPs基因多态与乳腺癌患病风险的关联分析Table 2 CASP3 TagSNP polymorphisms and their association with the risk of breast cancer

CASP3单体型分析结果显示，GGA是最常见的单体型，其在乳腺癌组和对照组中分别占66.93%和65.54%，其次为AGG单体型，在乳腺癌组和对照组中分别占14.74%和16.33%;位居第三的是GCG单体型，在乳腺癌组和对照组中分别占9.36%和8.57%;其余单体型的构成均不足5%。CASP3的单体型在两组间的分布无统计学差异(χ2=4.694，P=0.584)。以单体型GGA作为参照，未发现其他单体型与乳腺癌遗传易感性存在统计学关联(表3)。

表3 CASP3单体型与乳腺癌患病风险Table 3 CASP3 haplotype frequencies and their association with the risk of breast cancer

3 讨论

CASP3在细胞凋亡过程中起着不可替代的作用。CASP3基因转染昆虫Sf9细胞后可引起细胞凋亡，这个过程可以被BCL-2阻断;但是在发生凋亡的细胞提取液中去除CASP3后，这些提取液就失去了诱导细胞凋亡的能力;再加入纯化的CASP3它就又恢复了致凋亡的功能［9］。多数的研究表明，肿瘤细胞过度增殖和凋亡受抑共同参与了细胞的累积和肿瘤的形成。CASP3蛋白在多种肿瘤组织呈低表达［10-13］。研究发现，CASP3的表达在乳腺腺病、乳腺纤维腺瘤、乳腺癌中逐渐降低(P=0.000)，并且在乳腺癌中CASP3蛋白表达率越低，其临床分期越高(P=0.010)。

Lan等最早报道了CASP3基因多态与多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤的相关性，发现rs1049216 C等位基因显著降低多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤的发病风险［5-6］。Jang［7］的研究发现，携带 CASP3-928A＞G、77G＞A和17532A＞C多态位点，以及它们单体型的个体，罹患肺癌的风险显著降低。而另一项研究发现，rs4647601 TT基因型能显著增加头颈部癌的发病风险(OR=1.32;95%CI=1.00-1.37)［14］。然而，以上四项研究的基因多态选择策略均为候选基因选择策略，对于CASP3基因多态性分析不够全面。Xu［8］等应用TagSNP选择策略挑选SNPs，研究CASP3基因多态性与子宫内膜癌的关联，结果显示，rs2705901 CC基因型能显著增加子宫内膜癌的发病风险(OR=2.25;95%CI=1.03-4.95)。本研究结果显示，rs2696056与 rs2705901呈完全连锁不平衡，但未发现其与乳腺癌的罹患风险存在关联。这可能是本研究样本量较小，CC基因型的检出率低。目前针对CASP3 TagSNP的单体型研究尚未见相关报告;但是，从本研究结果来看，单体型的分析结果与单个SNP的分析一致，也未发现单体型与乳腺癌的发病风险间存在显著关联。

综上所述，基于浙江省嘉善县开展的自然人群为基础的现场病例对照研究，未能发现CASP3的 TagSNPs rs4647693、rs2696056、rs4647610 与乳腺癌的发病风险存在显著相关;对单体型的分析发现，GGA是最常见的单体型，单体型与乳腺癌的发病风险间也不存在关联。

［1］CROPP C S，NEVANLINNA H A，PYRHÖNEN S，et al.Evidence for involvement of BRCA1 in sporadic breast carcinomas ［J］.Cancer Res，1994，54(10):2548-2551.

［2］SLEE E A，ADRAIN C，MARTIN S J.Executioner caspase-3，-6， and -7 perform distinct， nonredundant roles during the demolition phase of apoptosis［J］.J Biol Chem，2001，276(10):7320-7326.

［3］GANGWAR R，MANDHANI A，MITTAL R D.Caspase 9 and caspase 8 gene polymorphisms and susceptibility to bladder cancer in north Indian population ［J］.Annals of surgical oncology，2009，16(7):2028-2034.

［4］PARK J Y，PARK J M，JANG J S，et al.Caspase 9 promoter polymorphisms and risk of primary lung cancer［J］.Hum Mol Genet，2006，15(12):1963-1971.

［5］HOSGOOD H D，3rd，BARIS D，ZHANG Y，et al.Caspase polymorphisms and genetic susceptibility to multiple myeloma ［J］.Hematological oncology，2008，26(3):148-151.

［6］LAN Q，ZHENG T，CHANOCK S，et al.Genetic variants in caspase genes and susceptibility to non-Hodgkin lymphoma ［J］.Carcinogenesis，2007，28(4):823-827.

［7］JANG J S，KIM K M，CHOI J E，et al.Identification of polymorphisms in the Caspase-3 gene and their association with lung cancerrisk ［J］.Mol Carcinog，2008，47(5):383-390.

［8］XU H L，XU W H，CAI Q，et al.Polymorphisms and haplotypes in the caspase-3，caspase-7，and caspase-8 genes and risk forendometrialcancer:a population-based，case-control study in a Chinese population［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009，18(7):2114-2122.

［9］MUNGER J，CHEE A V，ROIZMAN B.The U(S)3 protein kinase blocks apoptosis induced by the d120 mutant of herpes simplex virus 1 at a premitochondrial stage ［J］.J Virol，2001，75(12):5491-5497.

［10］WANG J X，ZHENG S.Caspase-3 and survivin expression in pediatric neuroblastoma and their roles in apoptosis［J］.Chin Med J(Engl)，2004，117(12):1821-1824.

［11］ISOBE N，ONODERA H，MORI A，et al.Caspase-3 expression in human gastric carcinoma and its clinical significance ［J］.Oncology，2004，66(3):201-209.

［12］DEVARAJAN E，SAHIN A A，CHEN J S，et al.Down-regulation of caspase 3 in breast cancer:a possible mechanism for chemoresistance ［J］.Oncogene，2002，21(57):8843-8851.

［13］KANIA J，KONTUREK S J，MARLICZ K，et al.Expression of survivin and caspase-3 in gastric cancer［J］.Dig Dis Sci，2003，48(2):266-271.

［14］CHENK，ZHAO H，HU Z，etal.CASP3 polymorphisms and risk of squamous cell carcinoma of the head and neck［J］.Clin Cancer Res，2008，14(19):6343-6349.