喷施草甘膦后叶肉细胞的扫描电镜观察

卜贵军 ，郑小江，崔 琳 ，王学东*

(1.生物资源保护与利用湖北省重点实验室(湖北民族学院)，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000;3.东北农业大学 生命中心，黑龙江 哈尔滨 150030)

草甘膦又叫农达，见绿杀，镇草宁，是一种广谱性的，内吸传导型除草剂[1-2].草甘膦经叶片表面的角质膜和气孔吸收后，在植物细胞中，被转化为水溶性的盐，它的运输的主要方式是，从韧皮部随着光合作用的产物，输送到生长旺盛的部位，属于由“源”向“库”的运输.由于是传导性除草剂，它可以杀死整个植株，其中也包括根，从而可以预防由根引起的再生[3]，达到斩草除根的功效.

草甘膦的化学结构与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的类似，这就使得草甘膦能与PEP竞争性抑制合酶的活性，形成EPSPS合酶-3-磷酸莽草酸-草甘膦的复合物，从而抑制了合成EPSP的EPSP合成酶[4-7]，阻断了莽草酸途径和芳香族氨基酸的合成.草甘膦阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，就会扰乱生物体正常的氮代谢而使植物体死亡.Sutton R F等的研究表明低浓度的草甘膦可能比高浓度的更有效[8].这是由于高浓度的草甘膦一接触植物就可以杀死组织细胞，而不能使草甘膦得到传递.而低浓度的草甘膦却可以在体内转运，直到达到根部和其他部位，杀死整个植株.

正是由于草甘膦的诸多优点，使得草甘膦的应用极为广泛.在施用草甘膦时杀草时，就可能导致草甘膦飘逸至农作物上，因此，有必要研究草甘膦对农作物的伤害.此前的研究一般都利用透射电镜来研究草甘膦对叶肉细胞的破坏[9]，用扫描电镜来研究草甘膦对表皮细胞的破坏[10].本研究利用扫描电镜，观察喷施草甘膦后大豆叶肉细胞的变化，比利用透射电镜更具立体感.

1 材料与方法

1.1 材料

大豆东农42(GlycinmaxL. Dongnong 42).

1.2 大豆叶片超微结构的观察

本试验年在东北农业大学农学试验站进行，行距65 cm，行长35 m，株距10 cm.

在幼荚期，天气晴好时，对实验区部分东农42的叶片施用草甘膦.草甘膦浓度按说明书比例配制{3∶400配药，由鹤壁市农林制药有限公司生产的草甘膦异丙胺盐(Glyphosate)，剂型：水剂含量：41%}.分别在第1次喷药前(0 d)和喷药后的第1-7 d的上午9:00～11:00，取第一叶脉与第二叶脉之间的部分，用双面刀片，切成宽度约为2 mm，长约5 mm的长条用于制备扫描电镜样.切好后将两部分用牙签轻轻拨入盛有用磷酸缓冲液配制的pH为6.8的戊二醛固定液的小瓶中，然后置于冰盒中.

扫描电子显微镜样品制备：将取回的样品经过固定后，在经过冲洗、脱水、置换、.用ES-2030(HITACHI)型冷冻干燥仪对样品进行干燥、粘样、镀膜：用E-1010(HITACHI )型离子溅射镀膜仪在样品表面镀上一层15 nm后厚的金属膜(金或铂膜).将处理好的样品放入样品盒式中待检.最后在日立公司的S-3400扫描电镜下观察，并拍照.

2 实验结果

2.1 大豆叶片栅栏组织细胞的扫描电镜观察

东农42的在没喷施草甘膦前，栅栏组织细胞，呈柱状，排列紧密，细胞非常规则(图版1-1)；喷药后第1天和第2天，栅栏组织细胞未见明显变化(图版Ⅰ-2,3)；喷药后第3天，栅栏组织细胞，出现变形，细胞变得不规则，有皱缩(图版Ⅰ-4)；喷药后4 d，栅栏组织细胞变形程度加大，细胞体积急剧减小，皱缩程度加剧(图版Ⅰ-5)；喷药后第5天以后，栅栏组织细胞变形非常严重，基本被瓦解(图版Ⅰ-6,7,8).

2.2 大豆叶片海绵组织细胞的扫描电镜观察

东农42的在没喷施草甘膦前，海绵组织细胞，非常规则(图版Ⅰ-1)；喷药后第1天没有明显变化(图版Ⅰ-2)；喷药后第2天，海绵组织细胞有一定皱缩，变形(图版Ⅰ-3)；喷药后第3天，海绵组织细胞，变形明显，皱缩加剧，细胞变得不规则(图版Ⅰ-4)；喷药后4天，海绵组织细胞变形程度加大，细胞体积急剧减小，皱缩加剧(图版Ⅰ-5)；喷药后第5天以后，海绵组织细胞变形非常严重，基本被瓦解(图版Ⅰ-6,7,8).

图1 喷施草甘膦后东农42叶片的栅栏组织和海绵组织的扫描电镜观察

3 结果分析与讨论

本试验利用扫描电镜，来研究草甘膦对东农42的叶片的栅栏组织和海绵组织的影响，结果发现，在按照说明书的浓度喷施草甘膦的情况下，栅栏组织和海绵组织在一定时间内对于草甘膦的胁迫都会有一定的伤害，而且随着天数的增加，伤害程度加大.研究发现海绵组织出现变形的时间比栅栏组织的稍早，这可能是由于草甘膦通过气孔进入叶片的速度要大于通过角质层进入的速度.栅栏组织在接近叶片的上表皮处，海绵组织在接近叶片的下表皮处，而上表皮的气孔数要少于下表皮的气孔数，因此从下表皮，也就是靠海绵组织一侧进入的草甘膦要比栅栏组织一侧要多，因此伤害也就越快.

草甘膦进入大豆东农42叶片后，通过细胞壁，细胞膜进入叶肉细胞，在叶肉细胞的叶绿体中，能够竞争抑制EPSPS的作用，从而使得东农42的芳香族氨基酸合成受阻，影响到含有芳香族氨基酸的蛋白质合成，以及芳香族氨基酸及其衍生物的代谢，由于草甘膦作用位置在叶绿体中，所以会导致细胞内部叶绿体变形，另外，由于草甘膦作为一种外界物理作用，可能会由于渗透压等的原因引起液泡等结构变化，从而在微观结构上表现出来.这与本人对于草甘膦对大豆叶片的透射电镜观察结果是一致的[9].

总之，草甘膦对叶肉细胞的所产生的伤害，可能是一系列综合因素的结果，一开始是由渗透压，以及对芳香族氨基酸合成抑制所造成的，以后是由于芳香族氨基酸及其类似物缺乏，影响蛋白质合成及代谢，使细胞内代谢崩溃所致.

参考文献:

[1]Malik J，Barry G,Kishore G. Minireview:The herbicide glyphosate[J]. Biofacrors，1989，2:17-25.

[2]Bradshaw L D，Padgette S R，Kimball S L，et al. Perspectives on glyphosate resistance[J]. Weed Technol，1997，11(1):189-198.

[3]Kennedy E R，Jordan P A. Glyphosate and 2，4- D: the impact of two herbicides on moose browse in forest plantations[J].Alces，1985，1:1-11.

[4]Sammons R D，Gruys K J，Anderson K S，et al. Reevaluating glyphosate as a transitionstate inhibitor of EPSP synthase: identification of an EPSP synthase EPSP glyphosate ternary complex[J].Biochem，1995，34(19): 6433-6440.

[5]Mcdowell L M，Klug C A,Beusen D D. Ligand of the ternary complex of 5-enolpyruvyl shikimate-3- phosphate synthase from rotational-echo double-resonance NMR[J].Biochem，1996，35(17): 5395-5403.

[6]Saroha M.K. Sridhar P,Malik VS.Glyphosate- tolerant crops: Genes and enzymes[J].J Plant Biochem Biotechnol，1998，7:65-772.

[7]Tan S，Evans R,Singh B. Herbicidal inhibitors of amino acid biosynthesis and herbicide-tolerant crops[J]. Amino Acids，2006，30:195-204.

[8]Sutton R F. Glyphosate herbicide: an assessment of forestry potential[J].For Chronicle，1978，54(1):24-28.

[9]卜贵军， 郑小江， 王学东,等.草甘膦对大豆叶片超微结构及生化指标的影响[J].中国油料作物学报，2010，32(2):285-289.

[10]卜贵军.喷施草甘膦对大豆表皮细胞超微结构影响的研究[J].湖北民族学院学报:自然科学版，2011，29(1):15-18.