响应面法优化不同蛋白酶制备麦麸膳食纤维

黄纪念，王长虹，2，孙 强，宋国辉，芦 鑫，张丽霞

(1.河南省农业科学院 农副产品加工研究所，河南 郑州 450002;2.河南农业大学 食品科学技术学院，河南 郑州 450002)

膳食纤维是一种被称为“第七营养素”［1］，不能被人体消化吸收的多糖，但对人体具有十分重要的生理功能。研究表明，膳食纤维通过调节体内碳水化合物和脂质的代谢，影响矿物质的吸收，促进肠道蠕动，增进肠道内有益菌群增殖等生理作用［2］。因此，它对肠癌、便秘、肥胖病、糖尿病、心血管疾病等慢性疾病有一定的预防和治疗作用［3-5］。

麦麸是面粉加工的主要副产品，含有35%～50%的膳食纤维［6］，其中的纤维素和半纤维素，是优质的膳食纤维来源［7-8］。目前，麦麸膳食纤维制备方法主要有化学法、酶法、酶-化学法［9-12］。化学法制得的膳食纤维纯度较高，但色泽深、不易漂白;产品碱味重、口感不佳［6］，且加工条件较为苛刻，仪器设备要求高，并污染环境。酶-化学法制备膳食纤维中也需加入酸、碱、盐等，会造成盐残留，从而影响膳食纤维的适口性与安全性。酶法制备的膳食纤维品质较酶-化学法高，色泽浅，易漂白，无异味，条件温和，对环境污染小。因此，我们采用酶法从麦麸中提取膳食纤维，通过响应面优化实验确定最佳提取条件，并比较不同蛋白酶对麦麸膳食纤维纯度的影响。现将有关结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

小麦麸皮。郑州市面粉厂提供，原料麦麸组成成分为水分6.81%，总膳食纤维47.31%，脂肪2.16%，不溶性膳食纤维 45.30%，蛋白质15.78%，水溶性膳食纤维2.01%，淀粉19.14%，灰分4.86%。

中温 a-淀粉酶(4 000 U·g-1)、风味蛋白酶(20 000 U·g-1)和胰蛋白酶 (250 000 U·g-1)由GIBCO公司提供;糖化酶(100 000 U·g-1)和碱性蛋白酶 (200 000 U·g-1)Solarbio公司提供。

主要仪器与设备。UV-2800紫外分光光度计，上海尤尼柯公司;XMTA-608电热鼓风干燥箱，上海佳盛有限公司;Anke DL-5-B低速大容量离，上海安亭公司;HH-S恒温水浴锅，上海博迅公司;KS-600EI超声波清洗机，宁波海曙科生公司;ZDDN-Ⅱ全自动凯氏定氮仪，杭州托普有限公司;XS205分析天平，上海梅特勒-托利多公司;KLUP-IV-10艾柯超纯水机，台湾艾柯公司等。

1.2 麦麸膳食纤维制备工艺流程

1.2.1 原料预处理

过筛水洗麦麸:按原料麦麸与水1∶10(m∶m)配置浸泡30 min，然后过孔径0.125 mm(120目)的筛，水洗至澄清，以除去麸皮表面部分淀粉及其他杂质［13］。

分解植酸:取上述麦麸与水以1∶10(m∶V)的比例混合，用浓H2SO4调pH值至5.0～5.5，保持50～60℃，充分搅拌 10 h，用清水漂洗至中性［14］。

脱除脂肪:将上述湿麦麸加4倍于体积的无水乙醇并浸泡3 h，水洗至中性［15］，然后置于鼓风干燥箱，60℃烘干。

酶水解淀粉:取上述麦麸10.000 g(干基)，加入100 mL的水，55℃下，用100 g·L-1的柠檬酸调节pH值至6.0，同时加入4%(m∶m)的淀粉酶 (中温 α-淀粉酶∶糖化酶为1∶3，m∶m)，恒温搅拌2.5 h，沸水浴15 min灭酶。

1.2.2 酶解麦麸蛋白

将上述反应体系保持至设定温度，用2.0 mol·L-1的氢氧化钠调节pH值到设定值，再加入一定量的蛋白酶，酶解麦麸蛋白。酶解结束后，沸水浴15 min灭酶。然后冷却、水洗酶解剩余物至中性，60℃干燥24 h，得到麦麸膳食纤维。

1.3 麦麸基本成分测定

水分含量测定，直接干燥法 (GB/T5009.3.2003);蛋白质含量测定，凯氏定氮法(GB/T5009.5.2003);脂肪含量测定，索氏抽提法(GB/T5009.6.2003);灰分含量测定，直接灰化法(GB/T5009.4.2003);淀粉含量测定，酶水解法(GB/T5009.9.2003);膳食纤维含量测定，酶重量法(GB/T22224.2008)。

1.4 水解度测定

蛋白质水解度 (DH):采用pH-State法。

DH(%)=游离氨基态氮 (g)/总氮 (g)×100。

1.5 膳食纤维纯度测定

膳食纤维纯度测定 (%)=酶解后麦麸中总膳食纤维质量 (g)/酶解后的麦麸质量 (g)×100。

1.6 响应曲面 (RSM)实验设计

采用Box-Behnken设计，对工艺条件进一步研究，以获得最佳工艺参数。

1.7 实验数据统计与分析

采用Design Expert 7.1.2处理数据，P＜0.05为显著，P＜0.01极显著。无特殊说明，所有实验平行测定3次，结果均为平均值。

2 结果与讨论

2.1 不同因素对蛋白酶酶解效果的影响

从酶解蛋白过程考虑，分别了解酶解时间、pH值、酶解温度以及酶用量对麦麸蛋白水解度的影响，确定响应面实验因素水平，从而探讨最佳工艺条件。

2.1.1 时间

取麦麸10.000 g(干基)将碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶反应体系的pH值分别控制为8.5，7.5和 7.0，加酶量分别为 600 U·mg-1蛋白，750 U·mg-1蛋白，60 U·mg-1蛋白，酶解温度分别为60℃，55℃和55℃的条件下，研究时间对3种蛋白酶酶解麦麸蛋白水解的影响，结果如图1所示。

图1 时间对蛋白酶酶解效果的影响

从图1可以看出，酶解时间从0.5 h到2.0 h时，胰蛋白酶、风味蛋白酶水解度快速增加，2.0 h之后水解度增加缓慢，而碱性蛋白酶酶解时间从0.5 h到3.0 h时，水解度增加比较明显，3.0 h以后增加缓慢。这可能与酶解反应进行到一定时间后，蛋白酶酶解作用位点数目所剩很少，再延长酶解时间，水解度增加并不明显有关。因此分别选择3.0，2.0，2.0 h作为其他单因素实验的因素水平。2.1.2 温度

取麦麸10.000 g(干基)将碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶反应体系pH值分别控制为8.5，7.5和 7.0，加酶量分别为 600 U·mg-1蛋白，750 U·mg-1蛋白，60 U·mg-1蛋白，酶解时间分别为3.0，2.0，2.0 h条件下，研究温度对3种蛋白酶酶解麦麸蛋白水解度的影响，结果如图2所示。

从图2可以看出，温度从45℃变化到55℃时，胰蛋白酶、风味蛋白酶对麦麸蛋白的水解度随着温度的升高而增大，当温度为55℃时，水解度达到最大，超过55℃麦麸蛋白水解度呈下降趋势;对于碱性蛋白酶，温度从45℃变化到60℃时麦麸蛋白水解度随着温度的升高而增大，当温度为60℃时，水解度达到最大，超过60℃麦麸蛋白水解度呈下降趋势;因此分别选择60℃，55℃，55℃作为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶其他单因素的实验因素水平。

图2 温度对蛋白酶酶解效果的影响

2.1.3 pH值

取麦麸10.000 g(干基)将碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶的酶解温度分别控制为60℃，55℃，55℃，加酶量分别为 600 U·mg-1蛋白，750 U·mg-1蛋白，60 U·mg-1蛋白，酶解时间分别为3.0，2.0，2.0 h条件下研究 pH值对3种蛋白酶酶解麦麸蛋白水解度的影响，结果如图3所示。

图3 pH值对蛋白酶酶解效果的影响

从图3可以看出，对碱性蛋白酶，pH值从8.0变化到9.0时，麦麸蛋白水解度随着pH值的增大而增大，当 pH值为9.0时，水解度达到最大，超过9.0之后麦麸蛋白水解度呈下降趋势;pH对胰蛋白酶、风味蛋白酶水解度的影响整体趋势和碱性蛋白酶相似，但胰蛋白酶、风味蛋白酶对麦麸的最佳酶解 pH分别为7.5，7.0。因此取 p H为9.0，7.5，7.0分别作为其他单因素实验的因素水平。

2.1.4 加酶量

取麦麸10.000 g(干基)将碱性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶的酶解温度分别控制为60℃，55℃，55℃，酶解时间分别为3.0，2.0，2.0 h，酶解p H值分别为9.0，7.5，7.0条件下研究加酶量对3种蛋白酶蛋白酶酶解麦麸蛋白水解度的影响，结果如图4所示。

图4 加酶量对蛋白酶酶解效果的影响

从图4可看出，碱性蛋白酶加酶量从200～1 000 U·mg-1蛋白时，麦麸蛋白的水解度快速增加，超过1 000 U·mg-1蛋白时麦麸蛋白水解度增加非常缓慢。胰蛋白酶、风味蛋白酶加酶量对麦麸蛋白水解度的影响整体趋势与碱性蛋白酶相似，加酶量分别从 200～800 U·mg-1蛋白和 20～100 U·mg-1蛋白时，麦麸蛋白的水解度快速增加，超过800 U·mg-1蛋白和100 U·mg-1蛋白时麦麸蛋白水解度增加非常缓慢。这说明在底物浓度一定时，麦麸蛋白的水解效率取决于酶用量，酶用量越大，酶的催化位点与蛋白质分子相应位点接触几率越多，水解速度越快。

2.2 碱性蛋白酶酶解麦麸蛋白的条件优化

从单因素实验可以看出，碱性蛋白酶水解麦麸蛋白过程中，加酶量、酶解时间、酶解温度和p H都对水解度有较大的影响。因此在上述单因素实验基础上利用Design Expert软件，采用中心组合实验Box-Behnken设计方案［16-17］进行响应曲面实验设计［18］，考察4个因素之间的相互作用对酶解反应的影响 (表1)，确定碱性蛋白酶水解麦麸蛋白的最优工艺条件。

Box-Behnken中心组合中，加酶量因素 (X1)水平为800，1 000，1 200 U·mg-1，其编码值分别为-1，0，1;温度因素 (X2)水平为55℃，60℃，65℃，其编码值分别为-1，0，1;p H值因素 (X3)水平为8.5，9.0，9.5，其编码值分别为-1，0，1;时间因素 (X4)水平为2.0，2.5，3.0 h，其编码值分别为 -1，0，1。

表1 响应面分析实验的结果

利用Design Expert软件，对表1中的实验结果进行多元回归拟合，获得麦麸蛋白水解度对加酶量、温度、p H值、时间的二次多项回归方程:

从回归方程的方差分析结果 (表2)可见，本实验所选用的二次多项模型F值为14.30**，为极显著;失拟项在P=0.05水平上不显著，整个模型的R2为0.935，变异系数为3.153%。表明方程的因变量与全体自变量之间的回归效果显著，此回归方程能解释实际情况。

由回归方程的各项系数显著性检验可知，水解度方程的一次项显著，各因素的交叉项相互作用不显著，二次项极显著，说明各个具体实验因素对响应值的影响不是简单的一次线性关系，而是二次抛物面的关系。由于各个因素之间的交互作用在实验中基本上没有什么影响。所以在以后的实验中可以不考虑各个因素之间的交互作用。

表2 回归方程各项的方差分析结果

由Design-Expert统计分析软件作响应曲面及等高线图，分析加酶量、温度、酶解时间对碱性蛋白酶水解度的影响 (图5)。各因素及其交互作用对响应值的影响趋势可通过这组图直接反应出来。

从图5中可以看出，各因素之间对模糊综合评价值评价的影响有协同作用。加酶量X1对响应值的影响最大，是水解度的最主要因素，表现为曲线较徒;酶解时间X4次之。因此选择合适的加酶量和酶解时间，可获得麦麸的较高水解度。在3个对水解度影响较大的因素中，从大到小依次为加酶量＞酶解时间＞酶解温度，即加酶量对水解度的影响最为显著，酶解温度相对影响不大。

图5 加酶量、酶解温度和酶解时间的响应面

2.3 最佳实验条件确定

在所选各因素范围内，通过Design-expert7.0软件建立模型分析，得出利用碱性蛋白酶提取麦麸膳食纤维的最佳工艺条件为加酶量1 136 U·mg-1蛋白，酶解温度59.94℃，pH值8.91，酶解时间2.19 h，该条件下水解度预测值为24.02%。采用上述优化条件做验证实验，同时考虑到实际操作的情况，将优化温度修正为60℃，结果麦麸膳食纤维水解度为 24.13%，麦麸膳食纤维纯度为93.28%。

2.4 风味蛋白和胰蛋白酶酶解麦麸蛋白的条件优化

采用与前面碱性蛋白酶一样的研究方法，分别改用风味蛋白酶和胰蛋白酶，研究加酶量、温度、pH、时间对麦麸蛋白水解度的影响，并用响应面法优化这2种酶的最佳条件，比较碱性蛋白酶，胰蛋白酶，风味蛋白酶对麦麸蛋白水解度及膳食纤维纯度的影响。胰蛋白酶，风味蛋白酶的实验因素水平及其编码值如表3所示。

由表4可知，以水解度为指标，碱性蛋白酶，胰蛋白酶，风味蛋白酶在响应面优化的条件下，对麦麸蛋白水解能力大小顺序为碱性蛋白酶＞风味蛋白酶＞胰蛋白酶;膳食纤维纯度为碱性蛋白酶处理样品＞风味蛋白酶＞胰蛋白酶。

由表5实验结果可以看出，碱性蛋白酶，胰蛋白酶，风味蛋白酶都在相同酶活400 U·mg-1下，对麦麸蛋白的水解能力大小顺序为碱性蛋白酶＞风味蛋白酶＞胰蛋白酶。这可能由于碱性蛋白酶可以裂解Glu、Met、Leu、Tyr、Lys和 Gln的羧基端及Ala、val、Try［19］，较胰蛋白酶和风味蛋白酶水解麦麸蛋白能力更强。从纯度的角度来分析，3种酶中碱性蛋白酶为水解麦麸蛋白质的最佳蛋白酶。这与国外采用的商业碱性蛋白酶作为水解蛋白酶的研究结果相一致［20］。

表3 胰蛋白酶和风味蛋白酶实验因素水平及其编码值

表4 3种酶的酶解优化条件及膳食纤维纯度

表5 相同酶活下3种蛋白酶对麦麸蛋白水解度影响

3 小结

利用响应曲面法优化了碱性蛋白酶，胰蛋白酶，风味蛋白酶对麦麸蛋白的酶解工艺，碱性蛋白酶最佳酶解条件为加酶量1 136 U·mg-1，pH值8.91，酶解温度59.94℃，酶解时间2.19 h，水解度达到24.13%，膳食纤维的纯度为93.28%;胰蛋白酶最佳酶解条件为加酶量为1 345 U·mg-1，pH值为7.25，温度为55.00℃，时间为 2.30 h，水解度达到11.22%，膳食纤维的纯度为86.55%;风味蛋白酶最佳酶解条件为加酶量为126 U·mg-1，pH为7.00，温度56.80℃，时间2.80 h，水解度达到 4.87%，膳食纤维的纯度为63.38%。

以水解度为指标，在最优条件下，碱性蛋白酶的水解能力远大于胰蛋白酶和风味蛋白酶，其中以这3种酶得到的麦麸膳食纤维的纯度，碱性蛋白酶也明显优于风味蛋白酶和胰蛋白酶。因此碱性蛋白酶为酶解麦麸蛋白的最佳蛋白酶。

［1］ 孙颖，朱科学，钱海峰，等.小麦麸膳食纤维脱色工艺的研究 ［J］.食品工业科技，2008(6):242.

［2］ 汤葆莎，沈恒胜.麦麸膳食纤维制备及研究进展 ［J］.中国农学通报，2009，25(12):53-57.

［3］ 李应彪，陆强.麦麸膳食纤维的提取技术研究 ［J］.粮油加工与食品机械，2005，26(11):77-79.

［4］ Harold M R，Reeves R D，Bolze M S，et al.Effect of dietary fiber in insulin-dependent diabetics:insulin requirements and serum lipids［J］.J Am Diet Assoc，1985，85(11):1455-1461.

［5］ Klurfeld D M. The role of dietary fiber in gastrointestinal disease［J］.J Am Diet Assoc，1987，87(9):1172-1177.

［6］ 万萍，尹莉.小麦麸皮膳食纤维提取工艺研究 ［J］.成都大学学报:自然科学版，2008，27(2):92.

［7］ James W P T.The analysis of dietary fiber in food［M］.New York and Basel:Marcel Dekker Inc，1980.

［8］ 郑建仙.功能性食品 (第2卷)［M］.北京:中国轻工业出版社，1999:50-65.

［9］ 张守勤，马成林，左春柽，等.玉米高压淀粉糊流变特性的研究 ［J］.农业工程学报，1997，13(2):199-202.

［10］ 左春柽，张守勤，马成林，等.高压处理玉米淀粉的X射线衍射图谱分析 ［J］.农业工程学报，1997，13(2):206-210.

［11］ 刘延奇，李昌文，赵光远，等.超高压对玉米淀粉颗粒结构的影响研究 ［J］.农产品加工·学刊，2006，79(10):44-46.

［12］ 杨留枝，刘延奇，李昌文，等.介质对超高压改性玉米淀粉的影响 ［J］.食品科技，2007，185(3):42-44.

［13］ 曹新志，明红梅，熊俐，等.酶-化学法从麸皮中提取膳食纤维的工艺研究 ［J］.粮食与饲料工业，2009(4):28.

［14］ 余华.酶法提取麸皮膳食纤维的研究 ［J］.粮食与食品工业，2001(3):9-10.

［15］ 缪岳琴，刘学文，陈谨.麦麸活性膳食纤维提取工艺条件的优化研究 ［J］.河南工业大学学报:自然科学版，2005，26(5):78-79.

［16］ 黄璞，谢明勇，聂少平，等.响应曲面法优化微波辅助提取黑灵芝孢子多糖工艺研究 ［J］.食品科学，2007，10:200-203.

［17］ 李亚娜，林永成，佘志刚.响应面分析法优化羊栖菜多糖的提取工艺 ［J］.华南理工大学学报:自然科学版，2004，32(11):28-32.

［18］ 盖钧镒.试验统计方法 ［M］.北京:中国农业出版社，2004.

［19］ Adamson N，Reynolds J.Characterization of casein phosphopep tides prepared using alcalase:Detemination of enzyme specificity［J］.Enzyme and Microbial Technology，1996，19(3):202-207.

［20］ Luc Saulnier，Roger Andersson，Per Aman.A Study of the Polysaccharide Compotenents in Gluten［J］.Journal of cereal Science，1997，25:121-127.