吸烟对男性精液质量、精浆活性氧及精子凋亡率的影响

孙启玉,李 剑,韩迎春,薛承岩,关会臻,谢守军,张茉莉,张秀琴*

(1.承德医学院附属医院 a.检验科;b.普外科,河北 承德067000;2.隆化县医院 放射科)

吸烟对男性生殖能力的影响,特别是对精液质量的影响,近年来已引起社会的广泛关注。我们选择在我院就诊不孕患者及健康成年男性作为研究对象,对其精浆活性氧及精子凋亡率进行检测,以探索吸烟影响精液质量的机制。

1 材料和方法

1.1 研究对象

120例男性不育患者为2006年9月至2009年7月来我院就诊病例,均为婚后2年以上,未采取任何避孕措施,性生活正常,排除女方不孕原因的不育男性,身体健康,无大量饮酒和长期接触有害物质史,无生殖道感染和精索静脉曲张史等。不育非吸烟组研究对象的纳入标准:不吸烟且无被动吸烟史。不育吸烟组研究对象根据吸烟习惯和烟龄分为3组:A日吸烟量＜10支,且烟龄≤1年;B日吸烟量10-20支,且烟龄5-10年;C日吸烟量≥20支,且烟龄≥10年。根据纳入标准,不育吸烟组有63人,其中A组19人,B组22人,C组22人。正常对照组选用35例已生育正常健康体检男性,无吸烟史,无泌尿、生殖、造血及内分泌系统等疾病。

1.2 标本采集

禁欲2-7天后通过手淫取精于无菌广口瓶中,置37℃恒温箱中液化。液化后取部分精液25℃下,3 000 r/min离心15min,取上清液即精浆-20℃保存待测。

1.3 精液常规参数测定

按WHO手册推荐的标准方法检测精液量、粘稠度、液化时间、pH值等指标。采用CASA系统(北京伟力公司WLJY9000)检测精子总数、精子密度、精子活率和活力。

1.4 精浆丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量测定

采用南京建成生物技术工程有限公司生产试剂盒测定,按试剂盒说明书操作,用分光光度计读取吸光度值。

1.5 精子凋亡的检测

试剂:TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒由南京凯基生物技术有限公司提供;TritonX-100由北京拜尔迪生物公司提供。

方法:标本液化后,取10 μ l滴于多聚赖氨酸防脱玻片上,以推血片的方法制作精液涂片;浸入4%多聚甲醛中固定25 min,-20℃的乙醇中放置2 h;PBS漂洗3次,每次5 min;浸入封闭液,室温15-25℃封闭10 min;PBS漂洗 3次,每次5 min;浸入通透液中,冰上(2-8℃)促渗 2 min。PBS漂洗两次,样本周围用吸水纸吸干;每个样本滴加50 μ l TdT酶反应液,加盖玻片37℃避光湿润反应60 min;PBS漂洗3次,样本周围用吸水纸吸干;滴加 50 μ l Streptavidin-HRP-工作液,加盖玻片37℃湿润避光反应30 min;PBS漂洗 3次;滴加50 μ l DAB工作液,室温显色反应10 min;PBS漂洗3次,光学显微镜下检测。每张涂片随机取10个油镜视野(×1 000),计数凋亡精子数和精子总数,以凋亡精子数/精子总数×100%表示凋亡率。

1.6 统计学分析

采用SPSS11.5统计软件,两组间计量资料比较采用t检验,计数资料比较采用 χ2检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常对照组、不育非吸烟组及不育吸烟组精液常规参数、精浆MDA含量和精子凋亡率测定结果见表1 三组年龄比较无明显差异。不育非吸烟组及不育吸烟组精子密度、精子活率、a+b级精子百分率和精浆MDA含量低于正常对照组(P＜0.05),精子凋亡率显著高于正常对照组(P＜0.05)。不育吸烟组和不育非吸烟组比较精子密度、精子活率、a+b级精子百分率、精浆MDA含量显著下降(P＜0.05),而精子凋亡率显著增高(P＜0.05)。

2.2 A B C三组精液常规参数、精浆MDA含量和精子凋亡率测定结果见表2 三组年龄比较无明显差异。B组精子密度、精子活率、a+b级精子百分率、MDA含量低于A组,但统计学上无明显差异。B组精子凋亡率和A组相比也无统计学差异。C组精子密度、精子活率、a+b级精子百分率、MDA含量显著低于A组和B组(P＜0.05)。C组精子凋亡率显著高于A组和B组(P＜0.05)。

表1 各组精液常规参数、精浆MDA含量和精子凋亡率的比较

表2 不同吸烟量各组精液常规参数、精浆MDA含量和精子凋亡率的比较

3 讨论

近年来,吸烟与男性不育的关系日益受到关注,但吸烟对精子质量的影响各家报道不一。可能与吸烟者未能准确提供烟量、起始时间及某些未知的不育因素等有关[1]。本研究对健康男性、不育吸烟患者及不育非吸烟患者的研究结果显示不育吸烟患者的各精液参数值明显下降,且大烟量组精液质量下降最为明显。表明吸烟影响男性精液质量,并存在一定的量-效关系。

目前,吸烟对精液的作用机制尚不完全清楚。香烟中含有尼古丁、可尼丁、苯并α-芘、一氧化碳、镉等大量的有害物质。对男性的生殖功能的影响是多方面的。吸烟能使男性体内激素水平发生改变,与不吸烟者相比,吸烟男性血清中卵泡刺激素、雌二醇水平显著上升[2]。吸烟可以增加精液DNA的氧化损害。与不吸烟者相比,吸烟者精液DNA中的8-OhdG(DNA氧化损伤后的一种产物)增加50%,而维生素E的浓度下降32%[3]。长期重度吸烟还可干扰睾丸及附睾微循环和内环境的物质交换,影响睾丸生精细胞的发育过程,阻碍精子的发生和成熟[4]。

活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和男性生殖的关系已得到广泛研究。在男性生殖道中,抗氧化酶系统和非酶性抗氧化物成分使ROS的产生和清除保持动态平衡。适量低浓度的ROS在精子获能和顶体反应中有着重要的生理作用,但过量活性氧存在可导致细胞氧化应激损伤,使精子的活力下降、死亡率升高,并影响精子的顶体反应及受精功能,是导致男性不育的重要原因之一[5]。MDA作为活性氧与细胞多不饱和脂肪酸发生过氧化反应的主要产物,是脂质过氧化损伤严重程度的指标。MDA为极活泼的交联剂,可迅速与磷脂酰乙醇胺交联成荧光色素后与蛋白质、肽类或脂类结合成难溶的无生理活性的脂褐素沉积于细胞浆内,使细胞功能老化,从而使精子受到损伤,运动能力下降。因此通过检测丙二醛可了解活性氧的浓度。

本研究结果显示不育吸烟患者MDA含量显著高于不育非吸烟患者。C组MDA含量显著高于B组和A组。表明吸烟可以增加精浆活性氧含量,并且吸烟量越大,时间越长产生的活性氧含量越高。同时本研究结果显示不育吸烟患者精子凋亡率显著高于不育非吸烟患者,且C组最为明显。精子凋亡是精子受损的直接表现,可以反映吸烟对精子细胞的损伤情况。长期大量吸烟导致精子凋亡率显著增加是其增加精浆活性氧含量加重氧化应激损伤的严重后果。

由于吸烟可以增加精浆活性氧含量,加重损害精子细胞,导致精液质量显著下降,吸烟可以加重不育患者的病情,同时吸烟也可能是导致不育的唯一因素。对于成年男性尤其是育龄男性,我们应加强宣传力度,提倡不吸烟或戒烟,积极创造条件消除吸烟对人类健康的危害。

[1]武俊青,高尔生.吸烟对男性生殖功能的影响[J].生殖与避孕,2006,26(12):745.

[2]Ochedalski T,Lachowicz O A,Dec W,et al.Examining the effects of tobacco smoking on levels of certain hormones in serum of young men[J].Ginekol Pol,1994,65(2):87.

[3]Fraga CG,Motchnik PA,Wyrobek AJ,et al.Smoking and low antioxidant levels increase oxidative damage to sper m DNA[J].Mutat Res,1996,351(2):199.

[4]Agarwal A,Saleh RA,Bedaiwy MA.Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction[J].Fertil Steril,2003,79(4):829.

[5]Agarwal A,Sharma RK,Nalljella KP,et al.Reactive oxygen species as an independent marker of male factor infertility[J].Fertil Stefil,2006,86(4):878.