树舌液体发酵的培养基优化*

黄达明 ， 李 欣 ， 黄 翀 ， 张志才 ，4**， 孙文敬

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.江西省生物发酵食品添加剂工程技术研究中心，江西 上饶 334221；3.南京邮电大学通信与信息工程学院，江苏 南京 210046；4.北京绿科天成生物有限公司，北京 100089）

在糖尿病的治疗方面，目前降血糖的方法大部分是注射胰岛素，但这种治疗方法大都是短时的，并且易出现多种副作用。葡萄糖的吸收利用包括葡萄糖进入细胞以及葡萄糖在细胞内分解。葡萄糖进入细胞的主要方式是协助扩散，扩散速率受细胞内外葡萄糖浓度差值、扩散系数以及葡萄糖与细胞膜上载体的亲和力的影响。提高葡萄糖代谢，降低细胞内葡萄糖浓度有利于提高葡萄糖进入细胞的速率。糖耗量是反映糖代谢速率一个重要指标。肝脏又是机体吸收利用葡萄糖的重要器官之一。对于葡萄糖的消耗，国内外文献报道大都在细胞水平或体内分子水平上研究，且主要以刺激胰岛素分泌和耗氧量作为检测指标[1-8]，但是这两个指标不能准确地反应组织代谢水平。

树舌 （Ganoderma applanatum）属真菌门 （Eumycota）、担子菌亚门 （Basidiomycotina）、 层菌纲 （Hymenomycetes)、非菌褶目 (Aphyllophorales)、 灵芝菌科 （Ganodermataceae）、灵芝属 （Ganoderma），是重要的药用真菌之一。树舌主要成分包括多糖、甾体化合物、三萜、脂类、氨基酸以及微量元素等[9，10]。树舌性平，气微、味淡[11]，具有清热、消积、化痰、止痛等功效[12]。作为一种药用真菌，在人类治疗疾病方面发挥着重要作用。随着对树舌研究的不断深入，其药用价值已引起人们的高度重视。

试验以糖耗量为指标，对树舌发酵液提高离体肝脏糖耗量的条件进行了研究，筛选并优化出合适的树舌发酵条件，试图研究出其降血糖机理，以期为树舌大规模工业发酵生产相关降糖产品提供理论支持和科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

树舌：由中国科学院地球化学研究所连宾老师馈赠，现存于中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号AC CC52297。

1.2 培养基

麦麸固体培养基：麦麸15 g，水20 mL；种子培养基：马铃薯200 g（煮汁）、葡萄糖20 g，水1 000 mL；基础培养基：葡萄糖20 g、蛋白胨4 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁 0.5 g、 氯化钾 0.5 g、 硫酸亚铁 0.1 g， 水 1 000 mL，自然pH。

1.3 仪器设备

HH－S数显恒温水浴锅 （江苏金坛医疗仪器厂）；全自动高压蒸汽灭菌锅YX－400Z（上海三申医疗器械厂）；PSX智能型恒温恒湿培养箱 （宁波莱福特科技有限公司）；全控温恒温摇床 （YC－W冷冻型，镇江格瑞生物工程公司）；可见分光光度计7200（尤尼柯上海仪器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 菌种培养

将树舌菌种接种到麦麸固体培养基，30℃培养7 d后，转接入种子培养基，28℃、150 r·min－1培养 3 d， 以 10%接种量，转接入发酵培养基，在同样的条件下培养5 d。

1.4.2 单因素试验

不同的碳源、氮源、无机盐、营养因子、pH作为基础培养基成分。碳源优化分别以20 g·L－1的甘油、甘露醇、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、果糖、微晶纤维素、可溶性淀粉代替基础培养基中的碳源。氮源优化分别以4 g·L－1的酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、尿素和硝酸钾代替基础培养基中的氮源。无机盐优化分别以0.5 g·L－1的NaCl、 KCl、 CaCl2、 MgCl2、 FeSO4、 Fe2（SO4）3、 ZnCl2、CuSO4、MnCl2代替基础培养基作为无机盐。营养因子优化分别以 10 mg·L－1的 VB1、 VB2、 VB6、 VB12、 VC 和 3,5－二硝基水杨酸为营养因子。pH优化分别选择pH5、pH5.5、pH6、 pH6.5、 pH7、 pH7.5代替自然 pH。 分别比较不同的单因素，筛选出具有高糖耗量发酵液的碳源、氮源、无机盐、营养因子和pH。

1.4.3 正交试验设计

为了确定最优的碳源、氮源、无机盐和营养因子，设计了L18（37）正交试验，配成18种培养基，在250 mL三角瓶中装入培养液100 mL，每种设置3个重复，按照10%接种， 28℃、 160 r·min－1培养 5d， 测定糖耗量。

1.4.4 糖耗量测定方法

（1）发酵液的制备

发酵液离心 （4 000 r·min－1， 10 min）， 取上清液备用。

（2）离体肝组织的制备

试验小鼠 （昆明种雄性小鼠，6周龄，体重18 g～20 g，由江苏大学医学院动物实验中心提供）乙醚麻醉后取肝脏组织， 4℃条件下研磨离心 （4 500 r·min－1， 10 min），取上清液备用。

（3）糖耗量的计算方法

3,5－二硝基水杨酸比色测糖法[13，14]，测定发酵液中的还原糖含量A1。

取 0.5 mL 发酵液， 0.5 mL 肝脏上清液， 加入 pH7.4的 0.2 mol·L－1磷酸盐缓冲液 1 mL， 同时加入 2%葡萄糖（A0）和10 mg苯甲酸钠，定容至2 mL混匀。然后37℃水浴48 h后，用3,5－二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量A2。 糖耗量 （I）计算公式为

式中： A0、 A1、 A2同上。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 碳源对糖耗量的影响

碳源是培养基中的主要成分之一，能被微生物用来构成细胞物质或代谢产物骨架，以及为生物体生命活动提供能量。结果见图1。

图1 不同碳源对发酵液糖耗量的影响

从图1可以看出，以葡萄糖 （对照组）为碳源的发酵液糖耗量最高，为74.87%，其次是甘露醇为碳源的发酵液糖耗量为71.89%。以乳糖、麦芽糖、蔗糖、木糖和果糖为碳源的发酵液糖耗量相近，分别为66.33%、66.66%、69.74%、 68.37%、 67.73%。 以微晶纤维素和可溶性淀粉为碳源的发酵液糖耗量都比较低，均低于63%。可见，葡萄糖和甘露醇是较适合的碳源。

2.1.2 氮源对糖耗量的影响

氮源是微生物生长所需要的重要物质，主要用于合成菌体细胞物质 （氨基酸、蛋白质、核酸）和含氮代谢物。不同的微生物所需要的氮源不尽相同。结果见图2。

硫酸铵和蛋白胨 （对照组）作为氮源的发酵液糖耗量最高，分别为70.75%和71.91%。尿素和硝酸钾次之，为67.19%和 68.14%。酵母膏作为氮源的效果最差仅为64.08%，显著低于蛋白胨 （对照组）因此，正交试验中确定硫酸铵和蛋白胨作为氮源。

图2 不同氮源对发酵液糖耗量的影响

2.1.3 无机盐对糖耗量的影响

无机盐在微生物生长中的主要作用是构成菌体细胞成分，作为辅基、辅酶、抑制剂或激活剂。无机盐参与机体内酶活性的调节，同时无机盐还能够调节培养基的渗透压、pH、氧化还原电位等，因此无机盐在微生物生长代谢过程中起着非常重要的作用。试验选择了KCl、NaCl、MgCl2、 ZnCl2、 CaCl2、 MnCl2、 FeSO4、 CuSO4和 Fe2(SO4)3对发酵液糖耗量的影响，并以不加无机盐作为对照。结果见图3。

图3 无机盐对发酵液糖耗量的影响

从图3可以看出，添加无机盐后糖耗量较高的是FeSO4、 KCl、 ZnCl2， 分 别 是 81.49%、 79.22%和 71.87%，均高于对照组 67.77%。 添加 MgCl2、 CaCl2、 NaCl、 Fe2(SO4)3、CuSO4、 MnCl2的发酵液糖耗量分别为 65.67%、 68.12%、65.86%、 67.61%、 56.08%、 59.28%， 均低于对照组。 最终确定FeSO4、KCl、ZnCl2作为正交试验中的无机盐。

2.1.4 生长因子对糖耗量的影响

生长因子是体内参与反应催化剂重要辅酶，对酶活性起着调控作用。本试验选择了维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C并以不加生长因子的作为对照，测定对发酵液中糖耗量的影响。结果见图4。

从图4可以得出，加入不同生长因子的发酵液糖耗量没有明显的区别，与对照组的71.91%接近。说明生长因子在试验中没有显著的影响。

2.1.5 pH 对糖耗量的影响

pH对菌丝体代谢的影响表现为对菌体生长的影响和对产物合成的影响，试验分别选择 pH5、pH5.5、pH6、pH6.5、 pH7、 pH7.5， 并以自然 pH 作为对照试验对发酵液糖耗量的影响。结果见图5。

不同pH条件下，发酵液糖耗量分别为67.19%、63.81%、 51.78%、 65.22%、 66.66%、 68.97%， 但都低于作为对照的自然pH，为70.67%。因此正交试验选择自然pH。

2.2 正交试验

根据单因素试验的结果，选取葡萄糖、甘露醇、蛋白胨、 硫酸铵、 KCl、 FeSO4、 ZnCl2进行正交试验 L18（37），因素水平见表1，正交试验结果见表2，确定各组分优化比例。

表1 正交试验因素水平

正交试验结果表明，不同组合间发酵液糖耗量不同。各因素对发酵液糖耗量的影响大小依次为葡萄糖＞硫酸亚铁＞甘露醇＞氯化锌＞蛋白胨＞硫酸铵＞氯化钾，其中碳源葡萄糖对发酵液糖耗量的影响最大，无机盐氯化钾的影响最小。从糖耗量来考察各因素水平值，最适培养基组合应是葡萄糖 5 g·L－1、 硫酸亚铁 0.5 g·L－1、 甘露醇 5 g·L－1、 氯化锌 0.5 g·L－1、 蛋白胨 1 g·L－1、 硫酸铵 1 g·L－1、 氯化钾 0.5 g·L－1。

为了证实试验结果的可靠性，进行进一步验证，用上述最佳培养基进行发酵试验，测得发酵液糖耗量为88.62%。

表2 正交试验设计及结果分析

3 讨论与结论

肝脏是体内各代谢的主要靶器官之一，促进并提高肝脏的葡萄糖消耗量是糖尿病研究的重要课题。在本试验中，保持离体肝脏的活性是至关重要的。试验中加入防腐剂来保持离体肝脏的活性不受到体外环境的污染。体外反应48 h后显微观察，发现并没有受到杂菌污染，同时反应中的葡萄糖消耗完全。

本试验利用树舌发酵液提高离体肝脏糖耗量，通过单因素试验和正交试验得到了最佳优化培养基，即为葡萄糖5 g·L－1、 硫酸亚铁 0.5 g·L－1、 甘露醇 5 g·L－1、 氯化锌0.5 g·L－1、 蛋白胨 1 g·L－1、 硫酸铵 1 g·L－1、 氯化钾 0.5 g·L－1。发酵后糖耗量可达到88.62%，显著高于未优化培养基的74.87%。本试验表明树舌发酵液能够促进离体肝脏内葡萄糖消耗，达到提高糖耗量的作用，是潜在的降糖及治疗糖尿病药物。但其降糖机理及效应还需通过体内试验研究证实。

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