灵芝单核和双核菌丝培养条件的比较研究*

陈裕新 ， 夏志兰 **， 刘东波 ， 康信聪 ， 熊兴耀

（1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.国家中医药管理局亚健康干预技术实验室，湖南 长沙 410128；3.湖南农业大学生物质能源研究中心，湖南 长沙 410128）

灵芝 （Ganoderma lucidum）属真菌界、担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、灵芝科、灵芝属，为大型的药用真菌。有着 “仙草”的美誉，是名贵的药材，被广泛应用于药品和食品中，具有益心气、益肺气、安神补肝、坚筋骨、通九窍等多种药效，同时还兼有养生美容，延年益寿的功效[1]。

单核菌丝又名初生菌丝，是由孢子直接萌发形成的菌丝，每个细胞内只有1个细胞核；双核菌丝又称次生菌丝，是由二条遗传性状不同的异质菌丝相互融合而成，每个细胞内有2个细胞核，具有锁状联合，是形成子实体的菌丝形态。分离单核菌株是大型真菌杂交育种的必经之路[2，3]，同时也研究担子真菌极性、结合方式和交配型基因及遗传多样性分析的重要材料[4－7]。

目前，国内外对灵芝的栽培、药理作用研究较多，但对灵芝的孢子萌发、杂交育种及其单核、双核菌丝的遗传特性研究较少，本文就灵芝单核菌丝与双核菌丝的生长特性进行比较试验，为灵芝杂交育种提供理论依据和技术指导，为灵芝的基础生物学研究提供实验借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料美国灵芝 （Ganoderma americanense），由湖南农业大学食用菌研究所提供。

1.2 试验方法

采用钟罩法 （子实体弹射法）[8]收集无菌孢子，配置无菌孢子悬浮液，并梯度稀释到光学显微镜100×视野下只有2个～3个孢子，最后直接涂布至平板，置于28℃下暗培养，获得单个孢子萌发菌落。经光学显微镜观察均无锁状联合，为单核菌株，随机抽取6个单核菌株，并依次编号为P1 （Primary）、 P2、 P3、 P4、 P5、 P6。 将母种的双核菌株标记为S（Secondary）。

固体培养基配方 （培养基1）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾 1 g、硫酸镁 0.5 g、琼脂20 g，水1 000 mL， pH 值 6.5。

液体培养基配方 （培养基2）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁 0.5 g、蛋白胨2 g、酵母膏2 g， 水 1 000 mL， pH 值 6.5。

固体平板培养，每个菌株接10个培养皿，设置3个重复，接种后置于22℃下暗培养。

液体培养，采用250 mL三角瓶，每瓶装液150 mL，每个菌株接5瓶，设置3个重复。接种后放在22℃下静置24 h后，转入摇床培养。

1.2.1 单核、双核菌株在平板上的延伸直径

将7个不同菌株接种于培养基1。培养10 d后用量尺测量菌株在培养皿中延伸的直径大小。

1.2.2 单核、双核菌株在平板上的吐水数及平均直径

将7个不同菌株接种于培养基1。培养15 d后在光学显微镜100×视野下观察，记录每个视野下菌株的吐水数量和平均直径，并按球体体积公式计算出平均每个视野下吐水的总体积 （V），公式为：

注：n为吐水数量；d为平均直径。

1.2.3 单核、双核菌株在液体培养中的菌丝产量

将7个不同菌株接种于培养基 2。22℃、120 r·min－1黑暗摇瓶培养。7 d后纱布过滤收集菌丝，50℃下烘干称重。

1.2.4 单核、双核菌株的液体培养温度试验

将P4、S两个不同菌株接种于培养基2。设置19℃、22℃、 25℃、 28℃四个摇床培养温度梯度， 120 r·min－1黑暗培养。摇瓶培养7 d，纱布过滤收集菌丝，50℃下烘干称重。

1.2.5 单核、双核菌株的液体培养pH值试验

培养基2中pH值设置5、6、7、8、9共5个梯度，接种P4、S两个不同菌株。22℃、120 r·min－1黑暗培养。7 d后纱布过滤收集菌丝，50℃下烘干称重。

1.2.6 单核、双核菌株的液体培养光照试验

将P4、S两个不同菌株接种于培养基 2。在22℃、120 r·min－1， 0、 500 lx、 1500 lx 三个光照强度梯度培养。7 d后纱布过滤收集菌丝，50℃下烘干称重。

2 结果与分析

2.1 单核、双核菌株在平板上的延伸直径

不同菌株在培养皿平板上的生长情况比较见表1。

表1 不同菌株在培养皿平板上的生长情况比较

由表1可知，双核菌株S的延伸直径最长，为7.26 cm；各单核菌株延伸直径都远小于双核菌株，其中P4菌株延伸最长，为5.94 cm。菌株延伸直径由大到小排列依次为 S＞P4＞P1＞P6＞P5＞P2＞P3。 单核菌丝 P1 菌丝最浓厚，P4最薄。除单核菌株P1有较多气生菌丝外，其余都为匍匐生长。双核菌丝在固体培养基中的生长总体趋势强于单核菌丝，但菌丝浓密程度与单核菌丝差异不大，这可能由于单核菌丝的分枝能力较强，分枝生长的速率抵消了部分双核菌丝的生长速度。因此从形态上观察，菌丝浓密程度没有太大差异 （参看图4）。

2.2 单核、双核菌株在平板上的吐水数及平均直径

不同菌株在培养皿平板上的吐水情况比较见表2。

表2 不同菌株在培养皿平板上的吐水情况比较

由表2可知，双核菌株S的平均吐水数最少，仅为11.3个；各单核菌株的平均吐水数远多于双核菌株，其中单核菌株P4最多为95.7个。水珠平均直径以单核菌株P3的最大，为68.2 μm，双核菌株S次之；各菌株间直径大小差异较大。平均总吐水体积以单核菌株P6最多，为9.382×10－3mm3， 其次单核菌株 P3， 最少的为双核菌株。试验表明，单核菌丝对水分极其敏感，水分过多就立即以吐水的方式向外排水，单核菌丝对氧气的需要要敏感于双核菌丝 （参看图5）。

2.3 单核、双核菌株在液体培养中的菌丝产量

不同菌株在液体培养中的菌丝产量比较见表3。

由表3可知，菌丝产量由高到低依次为 S＞P4＞P6＞P5＞P2＞P3＞P1。其中，双核菌株S的液体培养产量最高，为0.3833 g·瓶－1； 其次为单核菌株 P4， 产量为 0.3567 g·瓶－1；单核菌株P1最低，为0.15 g·瓶－1。试验表明，双核菌丝在液体培养中的生长势强于单核菌丝，各单核菌丝间生长势差异较大，也说明各单核菌株间存在较大遗传差异。

表3 不同菌株在液体培养中的产量比较

2.4 单核、双核菌株的液体培养温度试验

不同液体培养温度处理对单核、双核菌丝产量的影响见图 1。

双核菌株S在温度22℃时，菌丝产量最高，为0.3650 g·瓶－1，是其最适生长温度。而单核菌株的最适生长温度则为25℃， 菌丝产量为0.3533 g·瓶－1。 由图 1的变化幅度可知，单核菌丝对温度变化感应比双核菌丝的敏感，产量随温度变化较大。试验表明，单核菌丝对温度变化敏感于双核菌丝。

2.5 单核、双核菌株的液体培养pH值试验

不同液体培养pH值处理对单核、双核菌丝产量的影响见图2。

双核菌株S在pH值为5时，菌丝产量最高，达到了0.4833 g·瓶－1。而单核菌株的最适生长pH值则为6，菌丝产量为0.42 g·瓶－1。由图2的变化幅度可知，单核菌丝对pH值变化的感应比双核菌丝的敏感，产量随pH值变化较大。试验表明，单核菌丝对pH值变化敏感于双核菌丝。

2.6 单核、双核菌株的液体培养光照试验

不同液体培养光照处理对单核、双核菌丝产量的影响见图 3。

由图3可知，单核、双核菌株最适宜的光照强度都为0， 产量均达到最高值， 分别为 0.3867 g·瓶－1和 0.38 g·瓶－1，即黑暗都有利于菌丝生长，光照对菌丝生长有抑制。由图3变化幅度看出，随着光照增加，双核菌株产量递减程度要大于单核菌丝，即光照变化对双核菌株的影响比单核菌株大，双核菌丝对光照更为敏感。不同菌株在平板上的生长情况见图4～图7。

3 小结与讨论

单核、双核菌株在平板上的延伸直径和液体培养中的菌丝产量2个实验中，多个单核菌株间生长速度和生长势出现了一定程度差异性，这与何培新[9]、李荣春[10]等在研究单核菌株时所出现菌株间差异性结果相似。这可能由于在双核菌丝减数分裂形成孢子过程中，遗传物质再次分配，出现不同基因型，从而表现出较大的差异性。此外，2次试验的菌株生长速度和生长势大小排列顺序基本一致，只有P1出现了较大偏差，这可能由于P1菌株具有较多的气生菌丝，生长过程中需要较多氧气，而在液体培养中由于供氧较少，氧气便成为其生长的最大影响因素，因此液体培养菌丝产量较低，而固体培养中菌丝生长最快。

在水分、温度、pH值的差异方面，单核菌丝适应能力都弱于双核菌丝。但在光照试验中，单核菌丝对光照变化的适应性上要强于双核菌丝，双核菌丝对光照更为敏感，这可能由于双核菌丝在形成子实体过程中具有对光照的感性，而单核菌丝则没有或不强。在单核菌丝结合形成次级菌丝过程中，增强了对光照的敏感性，用来加强子实体原基形成对外界环境因素的感应能力；因此适量光照处理可诱导一些食用菌子实体原基形成。单核菌丝生长势总体弱于双核菌丝，表现在对环境因素变化的适应能力[11，12]。

自然界许多植物都有吐水现象，当土壤水分充足，空气潮湿，无风且温度较低的天气，未受伤的植物可从叶尖、叶缘部位的水孔向外溢出液滴，叫做吐水现象[13]。大型真菌菌丝体中吐水现象比较少见，通过显微观察手段才能清晰看到吐水现象。单核、双核菌丝均能在一定条件下吐水，单核菌丝对水分更敏感，因此吐水现象更频繁。

灵芝单核菌株与双核菌株在水分、温度、pH、光照上都存在较大生理形态差异，双核菌株对环境适应能力要强于单核菌株。

[1]林志彬，赵大明，许瑞祥，等.灵芝的现代研究 （第三版）[M].北京大学医学出版社，2007.

[2]杨新美.中国食用菌栽培学[M].北京：中国农业出版社，1988.

[3]黄年来.中国食用菌百科[M].北京：中国农业出版社，1993.

[4]潘迎捷，陈明杰，汪昭月，等.香菇交配型基因的遗传研究Ⅱ香菇孢子单核体和原生质单核体形态与生化性状上的差异[J].食用菌学报，1997，4(2)：1-4.

[5]姚方杰，李玉.金顶侧耳交配型系统特性的研究[J].吉林农业大学学报，2002，24(2)：61-63.

[6]Gupta B,Niranjan Reddy BP,Kotasthane AS.Molecular characterization and mating type analysis of oyster mushroom(Pleurotus spp.)using single basidiospores for strain improvement[J].World J Microbiol Biotechnol,2010(6)：10-12.

[7]CHENG Shui-ming,LIU Fan-xue.Genetic analysis of distorted segregation ratio of mating types among basidiospores in Lentinula edodes[J].Agricultural Sciences in China,2008,7(4):415-422.

[8]李荣同，龚光禄，包水明，等.菌核侧耳担孢子收集及萌发条件[J].食用菌学报，2010，17(1)：44-47.

[9]何培新，申进文，罗信昌，等.木耳孢子单核菌株培养性状多态性研究[J].食用菌学报，2003，10(2)：1-4.

[10]李荣春.双胞蘑菇96.4菌株及单孢菌株在生长、结实和杂交方面的变异[J].云南大学学报：自然科学版，2001(23)：21-27.

[11]刘明月，何长征，谭金莲，等.光质对金针菇子实体生长发育的影响[J].中国食用菌，1997，6(16)：11-12.

[12]张桂香，李彬.日光温室内不同光照强度对食用菌生长发育的影响[J].甘肃农业大学学报，1999，3(34)：291-295.

[13]卞勇，潘晓琳.植物吐水现象的观察[J].植物杂志，1995(5)：38.