糖尿病大鼠组织非酶糖化、细胞凋亡与糖尿病肾病的关系

刘长山 王秀军 柳 林 孙丽萍 刘海霞 明 义 (潍坊市人民医院内分泌科，山东 潍坊 261041)

高血糖导致的蛋白质非酶糖化是糖尿病肾病(DN)的重要发病机制〔1〕。有研究证明细胞凋亡参与了DN发生的整个过程。但非酶糖化与细胞凋亡的关系研究资料不多。本研究制备糖尿病大鼠动物模型，测定组织非酶糖化，观察肾脏细胞凋亡形态学改变及凋亡相关蛋白的表达，并予以非酶糖化抑制剂氨基胍进行干预治疗，以研究非酶糖化与细胞凋亡的关系，探讨抑制非酶糖化、防止细胞凋亡进而防治DN可能性。

1 材料与方法

1.1 动物、主要药品、试剂及仪器 清洁级雄性Wistar大鼠，体重180～200 g，6周龄，健康，由山东大学实验动物中心提供，合格证SCXK(鲁)20030004。链脲佐菌素(STZ):美国Alexi公司。氨基胍:美国Sigma公司产品。Bcl-2、Bax免疫组化测定药盒:北京中杉金桥生物技术有限公司。尿白蛋白测定试剂盒:天津DPC公司。One Touch血糖仪:美国强生公司。H-7500透射电镜，850型荧光分光光度计:日本HITACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠动物模型的建立 Wistar雄性大鼠30只，适应性喂养1 w后，随机取10只为正常对照组喂养常规饲料。其余20只拟作为DN组，左下腹腔按60 mg/kg体重单次注射STZ溶液，注射后72 h断尾取血测血糖(One Touch血糖仪)，血糖≥16.7 mmol/L为DN模型建立，并纳入本实验。

1.2.2 实验动物分组及药物干预过程 将20只模型大鼠随机分为2组进行试验，DN组，氨基胍治疗组;每组10只，各组间血糖值相差不大于1 mmol/L。大鼠在造模成功后即开始给药，每日灌胃给药1次，氨基胍组100 mg·kg-1·d-1，糖尿病对照组和正常对照组应用等容量生理盐水1 ml/100 g/d。灌胃开始后第4，8，12，16 w分别测定血糖和留取24 h尿液测定尿白蛋白定量，并记录结果。实验过程中，大鼠死亡1只，共29只大鼠完成全部实验研究。

1.2.3 动物处死与标本制备 16 w时，用10%水合氯醛按400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠处死大鼠。取右肾组织放于4%中性甲醛中固定，备进行免疫组化染色。取左肾少量皮质，备进行电镜观察。取左肾剩余皮质称重，置于-70℃冰箱保存，备进行非酶糖化测定。

1.2.4 肾皮质晚期糖化终产物(AGEs)测定 参照Nakayama等〔2〕和 Brownless等〔3〕方法进行羟脯氨酸含量测定，将测得的羟脯氨酸值乘以因子7.14，即为胶原含量。最后肾皮质中AGEs含量以每mg胶原中相对荧光强度(AUF/mg)表示。

1.2.5 Bcl-2、Bax蛋白免疫组织化学染色 常规石蜡切片，透明、复水，按1∶100比例稀释的小鼠抗大鼠Bax和Bcl-2抗体，滴加生物素化羊抗小鼠IgG二抗工作液，加辣根过氧化物酶标记的卵白素工作液，DAB显色。

1.2.6 肾组织透射电子显微镜超微结构观察 将肾组织切成1 mm3左右的小块，用3%戊二醛固定，1%锇酸后固定，Epon812包埋。用透射电镜下观察并拍照。每只动物的肾组织随机选12处肾小球基底膜和12处系膜区拍照，然后用图像分析处理仪计算出每个肾组织的平均肾小球基底膜厚度和平均系膜间隙面积。

1.3 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件进行处理，数据以±s表示，各组数据间的比较采用t检验和单因素方差分析。

2 结果

2.1 实验前后大鼠体重与血糖水平 药物干预前DN大鼠体重与正常对照组均无明显差异(P＞0.05)，血糖均显著高于正常对照组(P＜0.01);治疗16 w结束时，DN大鼠体重明显低于正常对照组，氨基胍治疗组血糖与治疗前比较无显著差异(P＞0.05)，DN两组间体重无明显差异(P＞0.05)。见表1。

2.2 氨基胍对DN大鼠肾组织非酶糖化的影响 治疗结束时，DN组AGEs含量明显高于正常对照〔(251.09±51.74)，(118.34±21.51)AUF/mg，P ＜0.01〕，氨基胍治疗组 AGEs含量明显低于DN组〔(139.18±36.4)AUF/mg，P＜0.01〕。

2.3 实验后各组DN大鼠尿白蛋白定量变化 随着实验时间的进展，糖尿病组大鼠尿白蛋白有上升趋势，用氨基胍治疗后尿白蛋白基本维持不变，治疗16 w末，氨基胍组尿白蛋白水平与4 w末相当，但糖尿病对照组尿白蛋白定量显著升高。见表2。

2.4 肾脏透射电子显微镜观察加细胞计量 DN组大鼠肾小球基底膜厚度明显高于正常对照组，用氨基胍治疗后，治疗组GBM厚度明显低于DN组但仍厚于正常组。肾小球系膜间隙面积DN组明显高于正常对照组。应用氨基胍治疗后，系膜间隙显著低于DN组，与正常对照组差异无显著性。见表3。

表1 各组大鼠体重和血糖比较(±s)

表1 各组大鼠体重和血糖比较(±s)

组别 n 体重(g)实验前 实验16 w后血糖(mmol/L)实验前 实验16 w后正常对照组 10 272.2±12.3 505.4±55.6 7.13±1.02 7.52±0.90 DN组 9 272.8±14.5 315.5±24.3 21.39±4.28 21.86±4.41氨基胍治疗组 10 271.8±10.2 298.2±26.9 20.89±4.60 22.41±4.19

表2 大鼠4～16 w尿白蛋白含量变化(x ± s，mg/L)

表3 肾小球基底膜厚度和系膜间隙面积(±s)

表3 肾小球基底膜厚度和系膜间隙面积(±s)

与正常对照组比较:1)P＜0.05;与DN组比较:2)P＜0.05

组别 n 肾小球基底膜厚度(nm) 系膜间隙面积(μm2)10 193.0±6.87 10.66±2.36 DN组 9 221.2±7.291) 16.66±3.401)氨基胍治疗组 10 222.6±6.212) 12.71±2.582)正常对照组

2.5 凋亡相关蛋白免疫组织化学染色结果

2.5.1 Bcl-2蛋白表达结果 Bcl-2蛋白主要位于肾小管，在细胞浆和细胞膜表达。正常对照组大鼠肾脏Bcl-2蛋白明显表达，DN组肾小管Bcl-2蛋白表达减少，而氨基胍治疗组Bcl-2蛋白表达较DN组增多。

2.5.2 Bax蛋白表达结果 Bax蛋白在肾小球、肾小管均有表达，表达在胞浆内。正常对照组表达较弱，DN组蛋白表达明显增多，而氨基胍治疗组Bax蛋白表达较DN组有所减少。

2.6 透射电子显微镜细胞凋亡观察 电镜下可见正常大鼠肾小管上皮细胞有微绒毛，细胞膜完整，细胞器丰富，基底膜质膜内褶，线粒体良好，无线粒体肿胀。DN组大鼠肾组织系膜细胞局部、核内染色质趋边浓缩、聚集、细胞核周间隙增宽，细胞线粒体明显肿胀，细胞质吞饮泡大量增多，有的线粒体出现空泡样改变，上皮细胞内可见凋亡小体。肾小管上皮细胞有细胞核固缩，核染色质边集。DN大鼠肾组织基膜内有系膜基质插入，治疗组大鼠肾组织细胞核固缩、染色质趋边减轻，线粒体肿胀不明显。

3 讨论

DN的发生发展与血糖升高程度、持续时间密切相关，高血糖导致的蛋白质非酶糖化是DN的关键启动因素，蛋白质的非酶糖化是指葡萄糖分子通过亲核添加作用而不须酶的催化即与蛋白质的氨基相结合，葡萄糖分子中的羰基先与ε氨基结合形成醛亚胺(aldimine)，即Schiff碱，这是一个不稳定的中间产物，Schiff碱进一步经过分子重排变成比较稳定的酮胺化合物，称为Amadori产物，Amadori产物比较稳定，反应的可逆性大大降低，Amadori产物大部分经过脱水和分子重排，形成复杂的、生理转化率很低的大分子AGEs〔4〕，AGEs的形成引起肾小球毛细血管结构和功能的改变，导致DN发生发展。

近年来大量研究显示，细胞凋亡在DN的发生与发展中起着重要作用，DN高血糖状态下的代谢紊乱使细胞凋亡增加是发生DN的重要原因，多种病理类型肾病的发生发展及损伤后的修复过程均伴随着细胞凋亡参与〔5〕。

凋亡相关基因可分为凋亡促进基因和抑制基因两种。这两类基因相互作用的结果决定细胞是生存还是凋亡。抑制基因中最具代表性的是Bcl-2，它可以阻止细胞凋亡〔6〕。Bcl-2基因的同源基因之一是Bax基因，它的过度表达可拮抗Bcl-2的保护效应而使细胞趋于凋亡。

蛋白质非酶糖化与细胞凋亡之间存在复杂的病理生理联系，Zoubin等发现AGEs可以通过多种途径导致细胞凋亡，①通过调节促凋亡基因Bax Blf-1 Nip-3和抗凋亡基因Bcl-2 Mcl-1的表达，诱导细胞凋亡。②通过细胞质和线粒体途径激活细胞凋亡相关酶(caspase-3，8，9)促使细胞凋亡〔7〕。

本实验中发现，糖尿病时高血糖通过可能通过增加肾脏非酶糖化而调节凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达，诱导肾小管、肾小球细胞凋亡而参与DN的发生发展。本实验认为氨基胍对DN的病理损害有明显的保护作用，因而使用非酶糖化抑制剂防治DN可能起到一定的效果。

氨基胍是一种亲质子肼类化合物，氨基胍比蛋白质中赖氨酸ε-氨基更活跃，通过与早期糖基化蛋白质Amadori产物或其衍生物如3-脱氧葡萄糖酮醛作用，使Amadori产物转化为替代性Amadori产物，阻止它进一步转变为AGEs。大量动物实验已表明，氨基胍可明显抑制AGEs的形成以及长期改善高血糖状态下AGEs在血管壁上的积聚，发挥其对DN的防治作用。但其毒副作用较大，限制了临床应用。DN病程迁延，这就决定其用药治疗的过程将是长期的甚至是终生的，药物的副作用及费用均应考虑。寻找毒副作用小、价格低的非酶糖化抑制剂用于防治DN将是今后努力的方向。

1 DCCT:The Diabetes Control and Complications Trial Research Group.The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus〔J〕.N Engl J Med，1993;329(14):977-86.

2 Nakayama H，Mitsuhashi T，Kuwajima S，et al.Immunochemical detection of advanced glyclation end products in lens crystallins from streptozocininduced diabetic rat〔J〕.Diabetes，1993;42(2):345-50.

3 Brownlee M，Vlassara H，Kooney A，et al.Aminoguani N dine prevents diabetes-induced arterial wall protein cross-linking〔J〕.Science，1986;232(4757):1629-32.

4 Gohda T，Tanimoto M，Moon JY.Increased serum endogenous secretory receptor for advanced glycation end-product(esRAGE)levels in type 2 diabetic patients with decreased renal function〔J〕.Diabetes Res Clin Pract，2008;81(2):196-201.

5 Sano K，Fujigaki Y，Miyaji T，et al.Role of apoptosis in uranyl acetateinduced acute renal failure and acquired resistance to uranyl acetate〔J〕.Kidney Int，2000;57(4):1560-70.

6 Tsujimoto Y，Croce CM.Analysis of the structure，transcripts，and protein products of bcl-2，the gene involved in human follicular lymphoma〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1986;83(14):5214-8.

7 Alikhani Z，Alikhani M，Boyd CM，et al.Advanced glycation end products enhance expression of pro-apoptolic genes and stimulate fibroblast apoptosis through cytoplasmic and mitochondrial pathway〔J〕.J Bio Chem，2005;280(13):12087-95.