结核/非结核分枝杆菌核酸快速检测方法临床应用价值

康丽军 洪峰 冯建兵 刘威 吴华 易俊莉 王甦民

(1.北京老年医院 北京 100095;2.北京结核病控制研究所 北京 100035;3.北京洛奇临床检验所 北京 102206)

结核/非结核分枝杆菌核酸快速检测方法临床应用价值

康丽军1洪峰2冯建兵3刘威1吴华1易俊莉2王甦民2

(1.北京老年医院 北京 100095;2.北京结核病控制研究所 北京 100035;3.北京洛奇临床检验所 北京 102206)

目的评价结核/非结核分枝杆菌核酸快速检测方法的临床应用价值>。方法应用实时荧光PCR技术对420例标本进行临床试验研究,并与抗酸杆菌涂片和分枝杆菌培养方法对照比较>。结果结核分枝杆菌核酸检测灵敏度为48.5%(其中菌阳标本灵敏度为95.8%,菌阴标本灵敏度为14.5%),特异度99.3%,阳性预测值为99.1%,阴性预测值为55.5%;临床试验388例痰标本中检测出1例非结核分枝杆菌核酸阳性,经测序确认,准确率100%;同时对32例非结核分枝杆菌临床分离株进行核酸检测,并经测序确认,准确率100%>。结论应用实时荧光PCR技术,能实现在1支管内同时进行结核分枝杆菌/非结核分枝杆菌的核酸检测。该方法具有简单快速、特异性好污染性少的特点。可作为实验室辅助检测结核/非结核分枝杆菌核酸方法之一。

分枝杆菌,结核;分枝杆菌属;核酸类;聚合酶链反应

结核病是由结核分枝杆菌复合群引起的疾病;而非结核分枝杆菌则引起NTM病。由于结核病和NTM病两者在发病、临床表现、影像学、涂片和培养、结核菌素试验、病理学检查等方面均十分相似,临床上很难进行区分诊断,只能从标本中分离出分枝杆菌,作菌种鉴定,才能确诊。而菌种鉴定往往需要1～2个月的时间,由于两种病的治疗方案不同,这样会延误对病人的诊断和治疗,同时也造成不必要的经济损失。随着分子生物学技术的引进,一些快速、简单准确的方法已应用于实验室,如常用的HPLC是通过分析分枝杆菌细胞壁的特异性成分结核菌脂酸(mycolic acid)和β-羟基-α脂肪酸的不同鉴定分枝杆菌,核酸的直接测序方法等国内外都有相关报道,并使分枝杆菌感染流行病方面长期存在的问题迎刃而解,但未见在1支管内同时能够检测结核/非结核分枝杆菌核酸的方法。我们采用实时荧光PCR[1-3]技术对本院收集的临床标本,在每1支管内同时检测结核/非结核分枝杆菌核酸,并对其应用价值进行评价。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 收集2009—2010年临床标本420例(包括32株PNB阳性临床分离株)。肺结核组：按中华医学会结核病学分会《肺结核诊断和治疗指南》规定[4]收集临床已确诊的结核病人痰标本235例,其中痰菌阳性样本97例,痰菌阴性病例138例。非结核肺部疾患病人痰标本103例(支气管肺炎51例,肺癌病人29例,肺脓疡7例,细菌性肺炎9例,间质性肺炎7例)。健康志愿者咽拭子标本50例。男性263例,女性157例,平均年龄52.9岁(最大96岁,最小14岁)。

1.1.2 标准菌株及临床分离株来源 结核分枝杆菌H37Rv,迪氏分枝杆菌,南非分枝杆菌,鸟分枝杆菌,胞内分枝杆菌,蟾蜍分枝杆菌,土地分枝杆菌,堪萨斯分枝杆菌,不产色分枝杆菌,施氏分枝杆菌,偶然分枝杆菌,爱知分枝杆菌,杜氏分枝杆菌,加地斯分枝杆菌,利英斯分枝杆菌,奥布分枝杆菌,副偶然分枝杆菌,罗德岛分枝杆菌,瘰疬分枝杆菌,耻垢分枝杆菌,海分枝杆菌,龟分枝杆菌,龟分枝杆菌脓肿亚种,草分枝杆菌各一株均来自于中国药品检定所。32株对硝基苯甲酸培养基(PNB)阳性非结核分枝杆菌临床分离株收集于本院与北京结核病控制研究所。

1.1.3 仪器 ABI 7700荧光PCR分析仪

1.1.4 试剂 博奥生物有限公司研究开发的结核/非结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)用于临床标本结核/非结核分枝杆菌核酸检测。批号：20080201

1.2 方法

1.2.1 痰、咽拭子抗酸杆菌染色涂片、培养及分枝杆菌菌种鉴定对硝基苯甲酸(PNB)生长试验：均严格按《结核病诊断实验室检验规程》操作。

1.2.2 实时荧光PCR方法 采用博奥生物有限公司研究开发的结核/非结核分枝杆菌核酸检测试剂盒,对临床采集标本进行抗酸、提取及PCR扩增。

1.2.2.1 核酸提取[5]按照参考文献[5]方法进行,并略做修改。简述如下：痰液及咽拭子中加入等量的4%NaOH溶液,震荡混匀。取1 ml液化后标本充分涡旋后12 000转/min离心5 min,弃上清。加入1 ml洗液,充分涡旋后 12 000转/min离心5 min,弃上清。加入50 μ l核酸提取液,充分涡旋转入核酸提取管中,放入核酸提取仪,最大转速振荡5 min。95℃水浴锅中放置5 min,瞬时离心,放置-20℃保存备用。

1.2.2.2 PCR扩增 取出扩增反应液,置于冰盒上,解冻,每个标本取核酸 2 μ l(吸取核酸尽量吸取上层液体),加入扩增反应液管中。然后进行PCR扩增：37℃300 s 1个循环;94℃180 s 1个循环;94℃15 s 40个循环;60℃30 s 40个循环;50℃10 s 1个循环。在检测时,同时选择FAM和HEX(或VIC)通道,采集荧光点选择在60℃30 s。每次检测均设阴性和阳性对照。阴、阳对照品加入量均为 2 μ l。

1.2.3 结果的分析判定 确定阳性和阴性对照品是否扩增正常。

正常阴性对照品：无S型扩增曲线,且Ct应为40或无任何数值。

正常阳性对照品：扩增呈S型曲线,且Ct应小于40。

以上2个条件应同时满足,否则,此次实验视为无效。

样品扩增呈S型曲线,且Ct值小于40的报告阳性,否则为阴性。

结果解释见表1。

1.2.4 DNA序列测定 对检测为非结核分枝杆菌(NTM)的样品核酸进行DNA序列测定,以验证荧光PCR检测结果。对扩增得到的PCR产物通过标准的Sanger DNA测序方法进行直接DNA序列测定(北京迈奥德恩生物科技有限公司)。

表1 结核/非结核分枝杆菌核酸(PCR-荧光探针法)检测结果解释

表2 M TB/N TM 细菌学(表型)与核酸检测结果(实时荧光PCR方法)

表 3 NTM 细菌学(表型)与核酸检测结果(实时荧光 PCR方法)

2 结果

2.1 本次试验共收集临床标本420例。以细菌学结果为对照,应用PCR-荧光探针法检测388例痰、咽拭子和32例临床分离株标本中结核/非结核分枝杆菌核酸。结核分枝杆菌核酸灵敏度为48.5%(其中菌阳标本灵敏度为95.9%,菌阴标本灵敏度为14.5%)特异性99.3%(其他肺部疾患和健康组共153例,核酸阳性1例)。阳性预测值为99%,阴性预测值为55.4%。在388例PNB阴性痰和咽拭子标本中;377例为NTM核酸阴性,特异性99.7%。1例NTM核酸阳性,敏感度100%。同时对32份PNB阳性临床分离株和23份(只做对照不统计在表内)非结核分枝杆菌标准菌株进行核酸检测,55份标本NTM均为阳性。敏感度为100%,并经测序加以确认,检测结果请见表2、3。

2.2 重复性 选取本次试验标本中46例,再次进行结核/非结核分枝杆菌核酸检测。符合率100.0%。

3 讨论

多年来,由于中国结核病的控制项目的实施和所取得的经验,进一步完善了现代结核病控制的策略和方法,但由于 HIV/AIDS的流行逐渐增加,NTM病的发病率迅速上升,美国研究表明HIV阳性者是感染NTM病的高危人群[6]。NTM病主要损害肺部,具有与结核病临床表现相似的全身中毒症状和局部损害表现,在无菌种鉴定结果的情况下,可能误诊为结核病,多数NTM对抗结核药物耐药。用抗结核药物治疗疗效不佳,并且药物会对患者的肝及神经系统有所损害,由于NTM病人和M TB病人在治疗上存在着差异。所以确定NTM感染病人在临床上有重要意义。传统方法鉴别MTB和NTM方法主要以细菌学为主,传统的PNB培养法是依据PNB在一定的浓度[7](含PNB500 mg/ml培基)下选择抑制结核分枝杆菌复合群的生长而不抑制非结核分枝杆菌生长原理,作为实验室常规检测项目,该方法由于周期长操作繁琐,不能及时为临床医生提供诊断依据,有其局限性。本研究采用博奥公司开发生产的《结核/非结核分枝杆菌荧光PCR试剂盒》对420例临床标本进行了核酸检测,该方法利用结核分枝杆菌和分枝杆菌特异性的核酸序列,采用双重实时荧光PCR技术和TaqMan探针技术实现对分枝杆菌的检测。分别针对结核分枝杆菌和分枝杆菌的特异性序列设计引物和探针,2个探针分别标记不同的荧光物质。当反应体系中有目的基因存在时,随着PCR反应的进行,就会释放出荧光。通过检测不同通道的荧光信号,来检测结果,从而实现在一管中同时检测结核和非结核分枝杆菌。

临床上诊断菌阴肺结核是长期存在的难点。根据中华医学会结核病学分会《肺结核诊断和治疗指南》中菌阴肺结核诊断标准,其中之一是指经痰涂片法和/或培养法进行分枝杆菌检查为阴性的活动性肺结核。对于结核病人标本,其结核分枝杆菌的检出结果受多种因素限制：包括病理状况,例如结核病变性质、病变严重程度、病变是封闭或开放的、病变排出的菌量及排出的间歇时间;结核分枝杆菌状态,例如代谢及繁殖是否旺盛、是否处于休眠状态,细菌形态多样性等因素。菌阴肺结核占全部肺结核的40%～60%。菌阴肺结核病人如果不给予治疗,近一半的病人将发展为涂阳,成为新的传染源[8]。本研究的荧光PCR方法是检测样本中的分枝杆菌核酸,如果病变处排菌量少或处于排菌间歇时间,则无法检测到样本中的分枝杆菌核酸。本方法的菌阴结核灵敏度(14.5%)低于其他作者报道的荧光PCR的灵敏度(约40%)[9],分析原因是本次试验选取的菌阴标本大多是临床诊断为稳定期的病人,痰标本连续三次以上取样均为涂阴培阴结果。在痰菌阴性标本中,可能标本量少的原因,PNB为阴性检出1例NTM阳性,经追踪检查为外地来京治疗非结核分枝杆菌感染病人。当地医院误诊误治了一段时间。所以对于菌阴结核的检测,需联合其他方法和临床诊断结果来确定。

长期以来,由于非结核分枝杆菌受到检查和鉴定菌种方法等因素的限制,分枝杆菌属的分类鉴定一直采用以表型特征为主的方法,随着分子生物学的发展,聚合酶联反应(PCR)PCR-限制性片段长度多态性分析,PCR-核酸杂交以及直接核酸测序技术为分枝杆菌的分类、鉴定开辟了新途径。本实验应用双重实时荧光PCR和 TaqMan探针技术,通过420例临床标本的分枝杆菌核酸检测,可以实现几个小时,在1支管内同时完成MTB/NTM分枝杆菌核酸检测。该方法特异性好,污染性少,为临床实验室分枝杆菌常规检测、流行病学NTM调查及分布状况提供一个快速准确的辅助检测方法。

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Clinical value of real-time FQ-PCR assay for detection of Mycobacterium tuberculosis/non-tuberculous mycobacteria

Kang Lijun,Hong Feng,Feng Jianbing,Liu Wei,Wu Hua,Y i Junli,Yi Junli,Wang Sumin
1.Beijing Old Hospital,Beijing100095,China;
2.Beijing Research Institute for Tuberculosis Control,Beijing100035,China;
3.Beijing Lawke HeaHh laboratory,Beijing102206,China

ObjectiveTo evaluate the clinical diagnostic value of real-time FQ-PCR assay for the detection ofMycobacterium tuberculosis(MTB)/non-tuberculous mycobacteria(NTM).Methods420 specimens were detected by real-time FQ-PCR,and the results were compared with those of AFB smear and culture.ResultsThe sensitivity of FQ-PCR was 48.5%,in which the sensitivity in bacterium-positive and bacterium-negative specimens were 95.8%and 14.5%,respectively.The specificity,positive predictive value and negative predictive value of FQ-PCR were 99.3%,99.1%and 55.5%,respectively.1 of 388 sputum specimens was NTM-positive by FQ-PCR,which was confirmed by DNA sequencing.32 NTM isolates were confirmed by FQ-PCR and DNA sequencing.Their accuracy was 100%.ConclusionsThe real-time FQ-PCR was a simple,rapid and specific assay for the detection ofMycobacterium tuberculosis/non-tuberculous mycobacteria in a sealed tube.

Mycobacterium tuberculosis;mycobacterum;nucleic acids;polymerase chain reaction

Hong Feng(hongfeng@bjhb.gov.cn)

洪峰(hongfeng@bjhb.gov.cn)

2011-03-05)

(本文编辑：张晓进)