正交试验法优选红参加工工艺

李卓艳， 李德坤， 周大铮， 叶正良， 李 萍

(1.中国药科大学中药学院，江苏南京 210009;2.天津天士力之骄药业有限公司，天津 300402)

人参为五加科植物人参Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根茎，主要分布于东北三省。人参中化学成分复杂，但是普遍认为主要有效成分是人参皂苷，约占4%。一般人参炮制后入药，其中，红参是最常见的炮制品。经过炮制后的红参除了容易保存外，还降低了有神经毒害的田七素，并且形成了新的人参皂苷，如抗肿瘤活性的Rg3和Rh2［1-5］。

近期对东北人参资源考察过程中发现，红参加工厂的红参加工工艺各不相同，这样势必造成红参内在质量的差异。这些加工厂注重的是红参的外在质量，对皂苷类成分的量及皂苷类指纹图谱并不关注。所以市场上红参质量参差不齐，同时由于品牌多且杂，企业间的内耗导致中国红参至今无法与西洋红参、高丽红参相抗衡。

为了给生产厂家提供一个统一的质量标准，我们参考加工厂的工艺，首次以人参总皂苷和高活性人参皂苷Rg3共同作为指标，采用正交加工方法对红参加工工艺进行优化［6-7］。

1 材料与仪器

1.1 材料 5年生鲜人参，鑫泰药业提供，经天津天士力之骄药业有限公司杨悦武研究员鉴定，为人参Panax ginsengC.A.Mey。

1.2 对照品 人参皂苷Re、Rg3为中国药品生物制品检定所购买(批号为110754-200822、110804-200402)。

1.3 仪器 Waters 2695高效液相色谱仪，2489紫外检测器;Hach DR 5000紫外分光光度计;DIKMA ProElutTMSPE小柱。

2 实验方法

2.1 红参加工正交试验设计 采用正交设计试验，对红参蒸制时间、烘干温度、烘干时间进行条件优选［8］，考察指标为人参总皂苷以及高活性皂苷Rg3。用L9(34)正交表安排实验。因素水平表见表1。

表1 因素水平Tab.1 Levels of factors

蒸制时间分为3阶段，50 min升温阶段，恒温阶段和30 min降温阶段，3阶段时间总和为正交表中蒸制时间［9-10］。试验烘干过程采取二次烘干法，第1次烘干根据正交试验表进行，第2次是把第一次烘干好的人参统一放入50℃的烘箱中烘至完全干为止［11-12］。实验共得9种红参样品。

2.2 人参总皂苷的测定

2.2.1 供试品溶液的制备 取红参100 g(红参原药材去芦头)，粉碎过4号筛，混匀，取5 g粉末，精密称定，置圆底烧瓶中，加入三氯甲烷50 mL加热回流3 h，弃去三氯甲烷液［1］;然后药渣挥干溶剂后，加入85%乙醇回流提取2次，每次加入量为40 mL，回流时间分别为2 h和1 h。提取液减压回收乙醇至无醇味，用0.5 mol/L氢氧化钠的20%的甲醇溶液转移定容至50 mL量瓶中。精密量取上述溶液10 mL，上预先处理好的DIKMA ProElutTMSPE小柱(先用约10 mL甲醇冲洗，再用0.5 mol/L的氢氧化钠的20%甲醇溶液约5 mL冲洗处理)，以0.5 mol/L的氢氧化钠的20%甲醇溶液5 mL冲洗，流出液弃去，再以20%甲醇溶液10 mL冲洗，流出液弃去，最后用甲醇洗脱收集于10 mL量瓶中至近刻度，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取人参皂苷Re对照品，加甲醇制成每1 mL含1.736 mg的溶液，摇匀，即得。

2.2.3 测定 精密量取对照品溶液20、40、60、80、100 μL及供试品溶液40 μL，分别置10 mL具塞试管中。置水浴中挥尽溶剂后取出，放冷，精密加新配制的5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混和液(2∶8)1 mL，摇匀。置60℃水浴中加热15 min，取出，立即置冰浴中冷却2 min。精密加冰醋酸5 mL，摇匀，在室温下放置5 min。以相应试剂为空白，在550 nm处测定吸收度，计算，即得。

2.2.4 方法学考察 应用该方法测定红参药材中的人参总皂苷，标准曲线为y=0.473 4x－0.012 2(0.347 mg/mL≤x≤1.736 mg/mL)，r2=0.999 2;重复性(n=6)RSD为1.33%;加样回收率(n=6)均在98.27% ～101.83%之间，RSD 为 1.40%。说明该方法可用于测定药材中人参总皂苷。

2.3 人参皂苷Rg3的测定

2.3.1 供试品溶液的制备 同2.2.1项。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取人参皂苷Rg3对照品，加甲醇分别制成每 1 mL含 0.400 mg、0.200 mg、0.100 mg、0.050 0 mg、0.010 0 mg 的溶液，摇匀。

2.3.3 色谱条件 Diamonsil TM C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱;以乙腈为流动相 A，以 0.05%磷酸溶液为流动相B，按表2进行梯度洗脱;检测波长为203 nm;柱温为30℃;体积流量1.0 mL/min;积分范围8～70 min。分别取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入色谱仪，测定。该色谱条件下，Rg3得到较好的分离。见图1。

表2 梯度洗脱程序Tab.2 Mobile phase program of gradient elution

图1 人参总皂苷Rg3对照品及红参药材样品色谱图Fig.1 Chromatograms of reference substance of Rg3and Ginseng Radix et Rhizoma rubra

3.3.4 方法学考察 应用该方法测定红参药材中的人参皂苷Rg3，标准曲线为y=8×106x+1 733.9(0.010≤x≤0.400 mg/mL)，r2=0.999 9;仪器精密度(n=5)RSD为0.10%;重复性(n=6)RSD为1.09%;样品在24 h内稳定性RSD为0.46%;加样回收率(n=6)均在98.13% ～100.74%之间，RSD为1.06%。说明该方法准确稳定，可用于测定药材中人参皂苷Rg3。

3 实验结果

3.1 正交试验结果 见表3。

表3 正交试验结果Tab.3 Results of the orthogonal test

3.2 人参总皂苷的方差分析 见表4。

3.3 人参皂苷Rg3的方差分析结果 见表5。

表5 方差分析结果-人参皂苷Rg3Tab.5 Variance analysis results of ginseng Rg3

4 分析与讨论

4.1 由表3和表4，因素A对人参总皂苷有极显著性影响(P＜0.01)，因素 C有一定影响(P＜0.10)，各因素对人参总皂苷影响的主次关系为A＞C＞B。从均值看，因素A和C各水平顺序均为K2＞K1＞K3，说明3个水平中，A2C2，即蒸制4 h，烘干10 h总皂苷质量分数最高。

4.2 由表3和表5，因素B和C对人参皂苷Rg3有一定影响(P＜0.10)。各因素对人参皂苷Rg3影响的主次关系为C＞B＞A。从均值看，因素C各水平顺序为K1＞K2＞K3，因素B各水平顺序为K3＞K2＞K1，说明3个水平中，B3C1，即70℃烘干8 h Rg3最高。

4.3 综合考虑人参总皂苷和Rg3的质量分数，我们最终选择的最优加工方案为A2B3C1，即鲜人参洗尽后，蒸制4 h，70℃下烘8 h，然后在50℃下彻底烘干。

5 验证试验

按上述优化的最佳条件，加工3批红参药材，并检测其人参皂苷Rg3和总皂苷。结果见表6。3批验证试验结果表明该工艺稳定可行。

表6 3批红参加工试验结果Tab.6 Test results of samples

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