HPLC法测定白芪龙胶囊中齐墩果酸和熊果酸

刘玉军， 代 龙， 孙明江， 马 睿

(山东中医药大学，山东济南 250355)

白芪龙胶囊是由白花蛇舌草、黄芪、天龙等多味 中药经先进的专利制备工艺制得的抗肿瘤六类新药，用于非小细胞肺癌(NSCLC)、肝癌等多种恶性肿瘤的治疗或辅助治疗，效果显著。白花蛇舌草为方中君药，现代研究表明［1］，其主要含齐墩果酸、熊果酸、黄酮类及多糖类成分，齐墩果酸具有促进淋巴细胞增殖和巨噬细胞吞噬的功能，以及迟发超敏反应的效应;熊果酸在与齐墩果酸相同的剂量下，对正常小鼠巨噬细胞的吞噬功能同样具有较明显的增强作用。为有效控制本制剂质量，保证其良好的抗肿瘤效果，笔者建立了HPLC法同时测定白芪龙胶囊中齐墩果酸和熊果酸的定量测定方法，从而为白芪龙胶囊质控方法的建立提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC－2010A型高效液相色谱仪，包括:UV检测器、CLASS-VP工作站(日本岛津公司);UV1100型紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司);AB135-S电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);KQ-250型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 齐墩果酸对照品(110709-200505)、熊果酸对照品(110742-200516)，均购自中国药品生物制品检定所;白芪龙胶囊(批号 20100301，20100302，20100401)，自制;甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相 甲醇-乙腈-0.1% 冰醋酸(80∶5∶15);检测波长215 nm;体积流量1.0 mL/min;柱温40℃。理论板数按熊果酸峰计算应不低于2 000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合对照品溶液 分别取齐墩果酸和熊果酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1 mL含齐墩果酸0.102 6 mg和熊果酸0.203 6 mg的混合溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 取本品内容物，研细，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解并定量转移至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 取白花蛇舌草以外的其余药味，制得不含白花蛇舌草的空白制剂，照供试品溶液的制备方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 精密吸取上述混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，按2.1项下色谱条件进行测定。结果供试品中齐墩果酸和熊果酸色谱峰能达到基线分离，且保留时间与相应对照品一致;阴性对照溶液在对应保留时间处无吸收峰，表明其余药味对齐墩果酸和熊果酸的测定无干扰，结果见图1～3。

图1 混合对照品HPLC图

图2 供试品HPLC图

图3 阴性对照HPLC图

2.3.2 线性关系考察 精密吸取2.2.1项下混合对照品溶液，分别进样 4、6、8、10、20、30 μL，按照2.1项下色谱条件进行测定。以齐墩果酸、熊果酸进样量为横坐标(X)，对应峰面积为纵坐标(Y)，分别绘制标准曲线，得回归方程分别为:Y=490 276.942 1X－ 1 265.765 3，r=0.999 9;Y=457 259.686 7X+14 380.960 3，r=0.999 9。结果表明，齐墩果酸、熊果酸进样量分别在0.410 4～3.078 0 μg、0.814 4 ～ 6.108 0 μg 范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 精密吸取2.2.1项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，重复测定5次，进样量10 μL。结果齐墩果酸、熊果酸峰面积的 RSD 分别为 1.32%(n=5)、0.92%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取上述供试品溶液(批号20100401)分别于配制后的1、3、5、7、9、12 h 测定齐墩果酸和熊果酸峰面积，进样量10 μL。结果齐墩果酸、熊果酸峰面积的RSD分别为0.75%(n=6)、0.81%(n=6)，表明供试品溶液在12 h内具有良好的稳定性。

2.3.5 重复性试验 取同一批次白芪龙胶囊(批号20100401)内容物，共5份，分别按2.2.2项下方法制得供试品溶液，照2.1项下色谱条件进行测定，进样量10 μL。结果制剂中齐墩果酸、熊果酸的平均质量分数分别为 0.338 4 mg/g、1.268 3 mg/g，RSD 分别为1.49%(n=5)、1.05%(n=5)，表明本测定方法重复性较理想。

2.3.6 加样回收试验 取已测定的白芪龙胶囊(批号20100401，含齐墩果酸 0.338 4 mg/g，熊果酸1.268 3 mg/g)内容物，共5份，各约1g，精密称定，分别精密加入混合对照品溶液(齐墩果酸0.020 52 mg/mL、熊果酸0.040 72 mg/mL)和甲醇各 25 mL，称定质量，其余按2.2.2项下方法操作，制得供试品溶液，照2.1项下色谱条件进行测定，进样量10 μL，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收试验结果(n=5)

2.4 样品测定 取3批样品按供试品溶液制备法制得供试品溶液，并按2.1项下色谱条件进行测定，每批样品测定3份，采用标准曲线法计算，结果见表2。

表2 样品测定结果(n=3)

根据上述测定结果及《广东省中药材标准》中白花蛇舌草项下的质量分数低限(总和≥0.08%)，确定本制剂中齐墩果酸和熊果酸总和的低限为0.83 mg/g［600 g药材 ×0.08% ×60%(转移率)÷(1 000粒 ×0.35 g/粒)=0.822 8 mg/g］，3 批制剂的质量分数均在低限以上，表明所制定的质量分数限度(总和≥0.83 mg/g)是合理的。

3 讨论

3.1 齐墩果酸和熊果酸结构中均无共轭体系存在，仅为末端吸收。经200～600 nm全波长扫描发现，齐墩果酸和熊果酸的最大吸收在206 nm左右，考虑甲醇在此波长范围内具有较强的末端吸收，对测定结果干扰较严重，参考相关文献［2-6］，最终确定在215 nm处测定齐墩果酸和熊果酸。

3.2 齐墩果酸和熊果酸同属于五环三萜类化学物，为同分异构体，极性相似，难以有效分离。笔者参考大量相关文献［7-11］，分别考察了甲醇-水(0.04%磷酸二氢钾)(87 ∶13)、甲醇-水(82 ∶18)、乙腈-甲醇－0.5%醋酸铵溶液(70∶10∶20)、甲醇-乙腈 －0.1%冰醋酸(83 ∶5 ∶12)、甲醇 －0.5%醋酸铵溶液(90 ∶10)、乙腈-甲醇-水-磷酸-三乙胺(50 ∶30 ∶20∶0.02 ∶0.04)等的分离效果，发现甲醇-乙腈 －0.1%冰醋酸(83∶5∶12)最佳，并进一步调整流动相比例为80∶5∶15。此时，齐墩果酸和熊果酸达到基线分离，且基线平稳、峰形对称，阴性无干扰。

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