星点设计-效应面法优化白芷的超声波辅助提取工艺

董自亮， 肖 丹， 何 健， 梅 雪

(成都中医药大学药学院，四川成都 611137)

白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)shan et Yuan的干燥根。其性温，气芳香，味辛、微苦，具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓的作用，被临床广泛应用于感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻渊、牙痛、白带和疮疡肿痛等症，并有较好的疗效［1］。白芷中总香豆素类为其镇痛的主要成分，又以欧前胡素、异欧前胡素和氧化前胡素为其主要成分，其止痛效果已被充分肯定［2］。

目前国内多采取正交设计优化药材的提取工艺，这种方法采用线性数学模型，虽有简便、实验次数少等优点，但精度不太高。星点设计(central composite design，CCD)［3-5］是近几年来国外药学工作者常用的集数学和统计方法于一体的实验设计方法，多采用非线性数学模型拟合，复相关系数高，应用已经成熟，具有精度高、预测性好、简便等优点。近年国内也有其用于优化处方或成型工艺的报道［6-9］。本实验引入星点实验设计-效应面法优选白芷的提取工艺，旨在优化白芷提取工艺的同时，为探讨该实验设计法应用于优化传统中药提取工艺可行性提供依据。

1 仪器与试药

KQ-300E型超声波清洗器(超声频率:40 KHz;超声功率:300 W;昆山市超声仪器有限公司);岛津LC-2010 AHT型高效液相色谱仪，岛津Class vp色谱工作站;电子天平(BP-211D，Sartorius，德国)。

白芷药材于2009年3月采自四川遂宁，经成都中医药大学马逾英教授鉴定为伞形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f的干燥根，符合《中国药典》2010版一部白芷项下的有关规定，阴干，粉碎，备用;欧前胡素对照品购自中国药品生物制品检定所(批号:110826-200712);所用水为纯蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 欧前胡素定量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱为 Dikama C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);检测波长:300 nm;流动相:甲醇-水(70∶30);体积流量:1 mL/min;柱温:30℃;进样量:10 μL;理论塔板数按欧前胡素峰计算应不低于3 000。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取欧前胡素对照品5.15 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密量取白芷提取液5 mL，加甲醇定容至10 mL，摇匀，进样前经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取10 μL不同质量浓度(5.150、7.725、10.300、12.875、15.450、18.025 μg/mL)的对照品溶液，按上述色谱条件测定，以峰面积与质量浓度进行线性拟合，得线性方程为Y=49 068X－1 443.3，(r=0.999 9，n=6)。结果表明，欧前胡素对照品溶液在5.150 ～18.025 μg/mL的质量浓度范围内具有良好的线性关系。

2.1.5 精密度实验 精密吸取同一对照品溶液10 μL，连续进样6次，按上述色谱条件测定，结果欧前胡素峰面积的RSD为1.70%。

2.1.6 稳定性实验 精密称取同一对照品溶液，分别在 0、2、4、6、8 h 测定，按上述色谱条件测定，得出RSD为1.62%，表明被测物在8 h内基本稳定。

2.1.7 重复性实验 同一批号白芷药材按照2.1.3项下方法平行制备5份，测定RSD为1.91%，表明方法的重复性良好。

2.1.8 加样回收实验 分别精密称取同一白芷药材粉末约0.2 g(约含有欧前胡素0.42 mg)9份，分成高、中、低3组，精密加入对照品适量，按照2.1.3项下平行制备供试品溶液，计算得平均回收率为101.86%，RSD 为 2.35%。

2.1.9 药材含量测定 取白芷样品，平行制备3份供试品，分别吸取10 μL进行测定，计算得白芷药材中欧前胡素的质量分数为0.21%(n=3)，色谱图见图1。

图1 欧前胡素对照品(A)与白芷提取液(B)的HPLC图

2.2 星点设计试验 白芷超声提取工艺的考察因素为乙醇浓度、料液比、超声时间、功率等，结合预实验结果和工业生产的实际，暂定超声功率为300 W，其余因素的水平据预实验的结果而定。因素水平表见表1，试验设计与结果见表2。

表1 星点设计因素与水平

2.3 模型拟合 以白芷欧前胡素的提取率为因变量对各因素进行多元线性回归和二项式拟合，使用SAS 9.0统计软件，拟合模型如下:

表2 星点试验设计与结果

多元线性回归:Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3，

多元线性回归:r=0.900 8，F=15.78，P=0.000 3＜0.01，尽管模型通过检验，但拟合度不佳，预测性较差，因此线性模型不合适。故对其二项式进行拟合，对各项系数进行t检验，删除P＞0.05的项，以达到简化模型的目的，结果见表3。

模型的复相关系数r=0.988 6，先删除最不可信的b7项，重新拟合，再根据P值依次删除b8、b5项，再拟合，结果见表4。

复相关系数r=0.973 8，相对于线性拟合有大幅提高，方程简化后r值降幅很小，表明该方程有较大的可信度。

表3 二项式非线性估计结果

表4 简化后二项式非线性估计结果

2.4 工艺优化和预测 因变量曲面图是三维图，只能表达含两个自变量的函数，因此固定三个自变量之一为中值，以拟合的目标函数为数学模型，应用Origin 7.5软件绘制因变量曲面图(见图2～4)，在图上选取提取率高的较佳工艺范围:X1:70%～80%;X2:65～75 min;X3:12～14倍;结合工业生产，故本实验选取白芷超声提取的最佳工艺为12倍量、75%乙醇提取70 min。

图2 乙醇质量浓度和提取时间对指标值欧前胡素的效应面图

图3 乙醇质量浓度和料液比对指标值欧前胡素的效应面图

图4 提取时间和料液比对指标值欧前胡素的效应面图

根据较佳工艺条件重复试验3次，结果与拟合方程预测值相比较，偏差为2.16%，见表5。

表5 验证实验结果

3 讨论

国内关于白芷超声提取工艺的文献少有报道，作者以欧前胡素为考察指标，优化了白芷超声提取工艺，同时改进了2010年版《中国药典》中白芷含量测定的色谱条件，结果表明本HPLC结果准确，灵敏度高、重现性好。

本课题组也对影响正交试验的因素乙醇浓度、料液比以及提取时间不同水平进行了正交试验优化，得到的正交设计的结果是加入14倍量的75%乙醇，提取75 min，3次验证后可得平均提取率为88.64%。由两者优化的结果可知:所用的乙醇浓度相等，两者的提取率无显著性差异，但是星点设计中溶剂用量较正交设计少，所用提取时间短于正交设计，考查因素的水平范围更大，最优工艺的选择不仅限于所设置的水平;由试验结果可知，星点设计的理论优化结果与试验值相差不大，由此可以看出采用非线性模型，更接近客观实际和便于找到极值范围，水平的选取更为直观，实验精度更高，预测性更好。

提取次数是影响白芷提取工艺的因素之一，由于提取次数为不连续变量，故前期未对提取次数进行考察。后期经过进一步试验考察与验证，按本工艺条件对白芷药材进行超声提取2次后，欧前胡素已基本提取完全，故确定最佳优化工艺为:以12倍量、75%乙醇超声提取2次，每次70 min。

致谢:研究得到通威股份有限公司药物研究所的帮助。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:98.

［2］魏玉平，刘 俊，颜小林，等.白芷治疗头痛的提取工艺评判指标的研究［J］.中草药，2001，32(4):318.

［3］Aberturas M R，Molpeceres J，Guzman M.Development of a new cyclosporine formulation based on poly(caprolactone)mierospheres［J］.J Microencapsul，2002，19(1):61-72.

［4］Wu X G，Li G，Gao Y L.Optimization of the preparation of nahnefene-loaded sustained-release micropheres using central composite design［J］.Chem Pharm Bull，2006，54(7):977-981.

［5］吴 伟，崔光华.星点设计-效应面优化法及其在药学中的应用［J］.国外医学药学分册，2000，27(5):292-298.

［6］吴云娟，沙先谊，李珺婵，等.星点设计-效应面优化法优化三七总皂苷鼻腔用粉雾剂［J］.中成药，005，27(1):10-15.

［7］孙 磊，王玉蓉.星点设计-效应面法优选远志的提取工艺［J］.中成药，2006，28(3):328-331.

［8］甘良春，侯世祥，毕岳琦，等.星点设计-效应面法优化丹参酮ⅡA纳米粒的制备工艺［J］.中国药学杂志，2007，42(10):758-761.

［9］伍 勇，贺福元，曹 燕，等.星点设计-效应面优化法对四物汤醇沉工艺的研究［J］.中国医药导报，2009，6(3):17-19.