整合素拮抗剂IS201对GL15胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

肖 宁，艾文兵，刘彦廷，冯定坤

(三峡大学，湖北宜昌443000)

脑胶质瘤是最为常见的原发性颅内肿瘤，其恶性程度高、生长快、侵袭性强，目前，临床上对脑胶质瘤的治疗效果不理想。2009年6月～2010年6月进行本研究，拟观察整合素拮抗剂IS201对体外培养的GL15脑胶质瘤细胞生长的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人GL15胶质瘤细胞。RPMI 1640培养基、小牛血清、MTT、DMSO、碘化吡啶(PI)、兔抗人增殖细胞核抗原(PCNA)多克隆抗体(一抗)、生物素化山羊抗兔IgG(二抗)、SABC试剂盒、胰蛋白酶、纯甲醇、5%BSA封闭液、整合素αvβ3拮抗剂IS201等。

1.2 MTT法 取对数生长期的GL15胶质瘤细胞，实验组分别加入 IS201，设定浓度为 25、50 μg/ml，对照组加入1640培养基，每种浓度设3个复孔，培养3 d。以570 nm为测试波长，20min内在全自动酶标检测仪上读取各孔吸光度(A)值，计算肿瘤细胞增殖抑制率。增殖抑制率(%)=［(对照组A值-实验组A值)/对照组A值］×100%。

1.3 免疫细胞化学法 取对数生长期生长良好的GL15细胞消化后，调整为1×104/ml的细胞悬液，以每孔200 μl接种到24孔板中，常规培养至细胞完全贴壁，弃上清液。分别加入含0(对照组)、25 μg/ml(实验组 1)、50 μg/ml(实验组 2)整合素αvβ3拮抗剂的细胞培养液200 μl，每种浓度设3个复孔。培养72 h后PBS洗涤2次，4%多聚甲醛固定20min后蒸馏水洗涤，室温干燥。采用免疫组化SABC法，严格按照试剂盒要求操作，以PBS代替一抗作为阴性对照，在高倍视野(×400)下随机选取5个不同视野，取5个视野的平均光密度值(ALD)。ALD越大表示PCNA表达水平越高。

1.4 流式细胞术 取生长良好的GL15胶质瘤细胞在6孔板中培养，细胞贴壁后弃上清液，分别加入含0、25、50 μg/ml整合素αvβ3 拮抗剂的细胞培养液，每种浓度设3个复孔。常规培养48 h后消化贴壁细胞，得到细胞悬液。使用流式细胞仪检测各孔细胞。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0软件对所得结果进行单因素方差分析，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 增殖抑制率结果 对照组、实验组1、实验组2 GL15胶质瘤细胞增殖抑制率分别为0、16.10%±8.86%、25.37%±7.15%，实验组与对照组比较抑制率均明显增加(P均＜0.05)，实验组2较实验组1抑制率也增加(P＜0.05)。

2.2 PCNA表达结果 对照组PCNA表达的ALD为0.698 4±0.037 6，实验组 1为 0.409 1±0.033 6，实验组2为0.287 6±0.043 7，两实验组与对照组比较差异均有统计学意义(P均＜0.05)，两实验组之间比较亦有显著性差异(P＜0.05)。

2.3 细胞凋亡结果 见表1。

表1 IS201对胶质瘤细胞周期的影响(%，±s)

表1 IS201对胶质瘤细胞周期的影响(%，±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05

组别 G0/G1 S G2/M SubG1对照组42.30±3.84 6.16±0.41 48.60±0.67 2.95±0.95实验组1 39.42±0.97 4.35±0.57 46.38±1.44 9.84±2.16*实验组2 37.30±1.02 8.84±1.12 41.27±2.58 12.54±0.46*

3 讨论

在胶质瘤发生发展过程中整合素αvβ3参与血管生成、多种生长因子与其受体相互作用、细胞与细胞及细胞与细胞外基质之间黏附等生理过程，亦与人体许多其他恶性肿瘤的发生发展、新血管形成和侵袭转移等病理生理过程密切相关［1］。但有关整合素αvβ3在脑胶质瘤恶性增殖、血管生成和侵袭性生长过程中作用的研究，仍处于探索阶段。研究表明，整合素αvβ3在胶质瘤中明显表达，且随着胶质瘤病理级别的升高，其表达水平明显升高，还与其血管内皮生长因子(VEGF)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达呈正相关［3］。这些事实提示，整合素αvβ3可能在脑胶质瘤的恶性生物学行为中发挥重要作用，整合素αvβ3极有可能成为人脑胶质瘤综合治疗中的一个很有前途的靶点。

体外实验证实，整合素αvβ3对胶质瘤细胞和血管内皮细胞的黏附、迁移和增殖能力有明显的促进作用［3］;抗整合素 αvβ3 的 LM609、抗整合素αvβ3和αvβ5的EMD121974等抗体，在体内外的实验中均显示出良好的抗胶质瘤血管生成及抑制体外培养的GL15脑胶质瘤细胞增殖和侵袭等作用［4］。这些研究结果进一步证实，整合素αvβ3对胶质瘤恶性生物学行为有正性调节作用。

IS201是另一种新发现的整合素αvβ3拮抗剂，不同于现有的整合素αvβ3拮抗剂，它有一个模拟RDG结合位点的环状结构，故是一种高选择性的整合素αvβ3拮抗剂［5］。目前对 IS201的研究尚处于实验室阶段，国内外的相关报道并不多。动物研究表明，IS201能够降低大鼠C6脑胶质瘤的血管生成和肿瘤细胞增殖，对C6胶质瘤的生长有明显抑制作用［6］。本课题通过实验观察IS201对体外培养的GL15人脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响，证实IS201对人脑胶质瘤确有抑制作用，为下一步将其应用于临床试验提供了理论基础。

［1］蔡强，叶应湖，王国安，等.血管内皮生长因子在人脑胶质瘤侵袭中的作用［J］.肿瘤防治研究，2002，29(6):447-449.

［2］艾文兵，陶胜忠，薛德麟.人脑胶质瘤中VEGF和整合素αvβ3的表达及相关性研究［J］.肿瘤防治研究，2005，32(2):70-72.

［3］D'Abaco GM，Ng K，Paradiso L，et al.ADAM22，expressed in normal brain but not in high-grade gliomas，inhibits cellular proliferation via the disintegrin domain［J］.Neurosurgery，2006，58(1):179-186.

［4］冯定坤，艾文兵，刘彦廷，等.整合素αvβ3抗体对胶质瘤细胞增殖和侵袭力的影响［J］.山东医药，2010，50(2):4-5.

［5］孙沛，许云禄.整合素及其拮抗剂研究进展［J］.药学专论，2007，16(1):1-3.

［6］艾文兵，冯定坤，熊志云，等.整合素αvβ3拮抗剂治疗大鼠脑胶质瘤的实验观察［J］.山东医药，2009，49(6):32-33.