热疗对膀胱癌BIU-87细胞凋亡和生存素表达的影响

刘春来，张西玲，刘屹立，王 平

(中国医科大学附属第四医院，沈阳110032)

热疗在肿瘤综合治疗中的地位受到越来越多的关注，热诱导凋亡杀伤肿瘤细胞的机制尚未明了［1，2］。2010 年3 ～9 月，本研究在体外培养条件下观察热疗对膀胱癌BIU-87细胞的作用及对生存素(survivin)表达的影响，对热疗抑制膀胱癌细胞的可行性及效果进行判定，并探讨热疗的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 膀胱癌细胞株BIU-87来自北京大学泌尿外科研究所。四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶、小鼠抗人survivin单抗及小鼠抗人同型对照IgG、羊抗小鼠 IgG-FITC、AnnexinⅤ-FITC试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 BIU-87细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养，培养液RPMI 1640含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素。细胞为上皮样贴壁生长，每2～3 d传代1次。取生长期细胞接种于培养瓶中，24～48 h后待细胞处于指数生长期，取出细胞用于实验。

1.2.2 MTT 法 细胞浓度为 2.5 ×104/ml，每孔加100 μl接种于3块96孔板，待6 h细胞贴壁后，置于37、39、41、43 ℃ 作用 2 h后再置于 37 ℃，培养24、48 和72 h后，每孔加 MTT(5 mg/ml，美国 Sigma公司)20 μl孵育 4 h，弃上清，加入 DMSO 150 μl，酶标仪570 nm处测吸光度A值。设3个复孔取均值，试验重复3次。计算细胞抑制率:细胞抑制率(%)=(1－实验组A值/对照组A值)×100。

1.2.3 survivin表达检测 BIU-87细胞5瓶，置于37、39、41、43℃作用2 h后重新置于37℃培养72 h，4%多聚甲醛4℃固定20 min，PBS洗涤，加入含0.25%Triton X2100 的 PBS 室温破膜 10 min，PBS洗涤，分别加入100 μl小鼠抗人survivin单抗及小鼠抗人同型对照 IgG(1∶100稀释)，室温孵育30 min，再加入 100 μl FITC标记的羊抗小鼠 IgG(1∶100稀释)，4 ℃避光孵育20 min，调整细胞浓度为1×106/ml。流式细胞术检测以同型对照管设置阳性界值，survivin抗原表达水平以平均荧光强度表示，试验重复3次。

1.2.4 细胞周期及凋亡检测 BIU-87细胞5瓶，置于37、39、41、43℃作用2 h后重新置于37℃培养72 h，70%乙醇固定细胞，加入碘化丙啶和AnnexinⅤ-FITC 4℃避光染色30 min，放入流式细胞仪的样品室，进行检测，试验重复3次。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS10.0软件进行统计学处理，方差分析检验各样本间的差异，SNK检验分析各样本间的两两差异。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 BIU-87细胞生长 热疗使细胞生长受到抑制，单纯热疗37℃ 24、48、72 h对BIU-87细胞抑制率分别为 4.92%、9.68%、14.53%，39 ℃ 分别为7.64%、16.53%、23.87%，41 ℃ 分别为 13.63%、20.94%、31.85%，43 ℃ 分别为 31.43%、41.76%、50.21%，不同温度热疗对BIU-87细胞抑制率各组间差异具有统计学意义，其抑制程度呈温度依赖性(P ＜0.05)。

2.2 survivin 表达 经 37、39、41、43 ℃ 作用后，BIU-87 细胞 survivin 表达分别为 5.60 ±2.24、3.20±1.36、0.70 ±0.21、0.20 ±0.06，呈温度依赖性减少(P ＜0.05)。

2.3 细胞凋亡及周期 热疗对BIU-87细胞作用后细胞周期及凋亡变化的影响见表1。

表1 热疗对BIU-87细胞作用后细胞周期及凋亡变化(%)

3 讨论

近年来热疗因其安全有效且毒副反应低已越来越多的应用于恶性肿瘤综合治疗。热作用既可以诱导细胞凋亡，又可以对细胞产生直接致死效应。研究表明热疗通常存在一个临界温度，在临界温度以下热诱导细胞凋亡，而临界温度以上则主要引起细胞坏死［1］。本研究热疗温度选择在37～43℃，建立不同作用时间、不同温度下热疗对膀胱癌BIU-87细胞细胞株作用的生长抑制曲线，发现热疗对BIU-87细胞生长有明显的抑制作用，并且抑制作用呈温度依赖性。结果显示，对于BIU-87细胞来说，引起凋亡的最佳条件是43℃。应用流式细胞仪检测，热疗除有效杀伤癌细胞外，还能诱导细胞周期阻滞，使受热作用后仍存活的细胞群发生细胞周期时相同步化，细胞周期阻滞与热诱导细胞凋亡和细胞增殖抑制密切相关。

热疗可以诱导凋亡相关基因的表达发生改变［2］，survivin是凋亡抑制蛋白家族重要成员之一，是迄今发现的作用最强的细胞凋亡抑制因子，不仅抑制细胞凋亡，还参与细胞周期的调控和新生血管的生成。研究表明［3］，survivin高表达于膀胱肿瘤中，是导致膀胱癌复发的可能性因素。survivin过度表达可能会帮助肿瘤细胞克服G2/M期的凋亡检测点，并且促进变形细胞通过有丝分裂的变异进程［4］。Wang 等［5］应用两种 survivin siRNA 靶向治疗骨肉瘤细胞MG-63，结果发现其可以显著促进细胞凋亡，并且增加阿霉素及顺铂的药物敏感性。本研究结果表明，BIU-87细胞中survivin的表达随温度的增高而逐渐降低，据此推测，热疗可能通过降低survivin表达从而诱导BIU-87细胞的凋亡，但热疗通过何种途径导致肿瘤细胞凋亡还需要深入探讨。

综上所述，热疗对人膀胱癌细胞株BIU-87有抑制其生长、增殖和诱导凋亡的作用，其促进凋亡的作用呈温度依赖性。由于热疗副作用小，可应用于膀胱灌注治疗和辅助治疗膀胱癌。

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