三种方法检测强直性脊柱炎患者HLA-B27的效果比较

赵晓君，薛 鸾，陈云飞，黄 岚，王 靖，蒋文燕

(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海200437)

强直性脊柱炎(AS)是一种主要侵犯脊柱，并可不同程度累及骶髂关节和周围关节的慢性进行性炎性疾病［1］。我国AS发病率为0.3%，男女比例约4∶1，发病高峰年龄为 16～31 岁［2］。研究表明，AS与人类白细胞抗原-B27(HLA-B27)具有很强的关联性［3］，后者已成为诊断与鉴别诊断 AS的重要依据［4］。目前临床上检测HLA-B27的方法有多种，比较常用的有微量淋巴细胞毒法(MLCT)、流式细胞术和序列特异性引物—聚合酶链式反应(PCR-SSP)法。2010年3～10月，我们分别采用上述三种方法对80例AS患者血清HLA-B27进行了测定，并对其诊断AS的敏感度、特异度等进行了比较。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 同期收治的80例AS患者(AS组)，男65例，女15例;年龄25～35岁，平均30.5岁。均符合1984年修订的纽约诊断标准，临床表现为腰椎活动受限、胸腰段或腰椎疼痛、胸廓扩张差≤2.5cm，X线表现为骶髂关节不同程度侵蚀性改变或关节间隙扩大或狭窄或部分强直等。选择85例同期查体健康者为对照组，男68例，女17例;年龄24～42岁，平均33.2岁。两组一般资料具有可比性。

1.2 血清HLA-B27检测及诊断AS 的价值参数计算 两组均抽取空腹静脉血3 ml，分别采用下述三种方法检测血清HLA-B27，并根据以下公式计算诊断价值参数:敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)，特异度=真阴性例数/(假阳性例数+真阴性例数)，阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)，阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)。

1.2.1 PCR-SSP法 ①模板DNA提取:采用天根DNA提取试剂盒自乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的静脉血中提取模板DNA。②PCR反应:采用HLA-B27分型试剂盒、ABI 9700 PCR仪，每孔反应体系包括Master buffer 10 μl、DNA 2 μl、Taq 酶 0.06 μl，反应条件为96℃预变性2.5min，96℃变性15 s，65℃退火60 s，共10个循环;95℃变性15 s，62℃退火50 s，72℃延伸30 s，共22个循环。③凝胶电泳分析:配制含0.5 μg/ml溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶，将12 μl聚合酶链反应产物依序加到电泳胶孔中，以10 V/cm电压强度电泳至酚红条带移动0.7～1.0cm。电泳完毕后将电泳胶移至Bio-Rad凝胶成像系统上摄取影像进行结果判读。HLA-B27基因阳性者核酸片段大小为140 bp，内部对照组核酸片段大小为600 bp。

1.2.2 流式细胞术 采用美国BD公司FACS Aria流式细胞仪、HLA-B27试剂盒。反应管中加入10 μl抗 HLA-B27 FITC/CD3PE，加入 30 μl抗凝血，振荡后室温孵育15min，加入1∶10稀释的溶血素1 ml，振荡后室温孵育10min，离心弃上清，加入2 ml PBS洗涤1次，离心弃上清，加入300 μl PBS溶液，振荡后上机检测。

1.2.3 MLCT法 ①分离淋巴细胞:取外周静脉血3 ml，用淋巴细胞分离液梯度密度法分离淋巴细胞备用。②抗原抗体反应:向包被好抗体的血清板孔底加入1 μl淋巴细胞悬液、1 μl新鲜溶解的兔补体，室温下孵育1 h，加入荧光终止剂终止反应。③结果观察及判定:Olympus荧光倒置显微镜下观察，呈红色者为死细胞、绿色者为活细胞。每孔淋巴细胞死亡率在0～20%积2分、21%～40%积4分、41%～80%积6分、80%以上积8分，平均积分1～2分为阴性、4～8分为阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS15.0软件进行统计学处理，率的比较行χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

两组血清HLA-B27表达情况见表1，三种检测方法诊断AS的价值参数见表2。

表1 两组血清HLA-B27表达情况比较(例)

表2 三种检测方法诊断AS的价值参数(%)

3 讨论

多项研究证实，血清HLA-B27阳性表达者易患AS。目前，血清HLA-B27检测已成为临床诊断和鉴别诊断AS的重要辅助手段，因此改进实验条件、选择一种有效且利于临床诊断的检测方法显得尤为重要。目前常用的几种检测方法中，MLCT法操作简便，不足之处为需要新鲜血至少3 ml且需足够的活淋巴细胞;难以获得高效价的单价血清，受细胞纯度、补体差异、单抗效价及HLA高度多态性影响，易出现漏检或假阳性;标本不能长期保存和送其他实验室验证等［5］。流式细胞术亦快捷简便，不足之处为需要新鲜抗凝血、标本不能长期保存、很多基层单位无流式细胞仪等。目前对于HLA-B27的研究已经深入到等位基因水平，国内外广泛应用的PCRSSP B27等位基因检测技术通过设计基于人基因组中HLA-B27基因的特定核酸序列，经PCR方法扩增出特异的HLA-B27基因片段，较流式细胞术更为快速、简便，且具有高度敏感性、特异性。

本研究显示，三种血清HLA-B27检测方法诊断AS的特异度均较高;PCR-SSP法、流式细胞术诊断敏感度均显著高于MLCT，其中PCR-SSP法略高于流式细胞术。此与李慧琰［6］及黄河等［7］的研究一致。但陈建华等［8］研究表明，PCR-SSP法检测HLAB27诊断AS的敏感度明显高于流式细胞术。以上结论不一致的原因可能为PCR-SSP法检测的是HLA-B27基因型，血清学技术检测的是HLA-B27表型，而携带B27基因者细胞表面并不一定有B27抗原表达。本实验中经PCR-SSP检测为阳性，流式细胞术及MLCT测定为阴性的标本可能与某些RA患者细胞表面HLA-B27抗原不表达有关。

综上所述，PCR-SSP法检测 HLA-B27表达快速、简单，且对AS诊断具有较高敏感度和特异度。

［1］Inman RD.Mechanisms of disease:infection and spondy loarthritis［J］.Nat Clin Pract Rheumatol，2006，2(3):163-169.

［2］王志瑾.现代流行病学［M］.北京:人民卫生出版社，2001:160.

［3］曹孟德，秦东春，孙含笑.HLA分子生物学及临床应用［M］.郑州:河南医科大学出版社，1998:203-216.

［4］Pei R，Arjomand S，Deng CT，et al.A monospecific HLA-B27 fluorescein isothiocyanate-conjugated monoclonal antibody for rapid，simple and accurate HLA-B27 typing［J］.Tissue Antigens，1993，41(4):200-203.

［5］洪俊，张平安，李艳，等.强直性脊柱炎患者人类白细胞抗原B27三种检测方法的对比［J］.检验医学，2006，21(1):1-3.

［6］李慧琰.PCR-SSP法与微量淋巴细胞毒试验检测强直性脊柱炎患者 HLA-B27 的比较［J］.医药论坛杂志，2010，31(5):78-79.

［7］黄河，孙燕燕，眭维国，等.流式细胞术和SSP-PCR法检测HLAB27 抗原的比较［J］.中国热带医学，2007，7(9):1662-1663.

［8］陈建华，魏文宁，喻喜.PCR-SSP法与流式细胞仪检测强直性脊柱炎患者HLA-B27的比较［J］.检验医学与临床，2007，4(3):161-162.