复方银翘散对五种常见耐药菌的体外敏感性研究

栾耀芳，孔祥山，吴 斌，李金星

(山东中医药大学附属医院，济南250011)

全国产β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌大肠感染率为56.5%、甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA)感染率为52.7%［1］，且除糖肽类抗生素外，几乎对其他抗生素均耐药。2010年11月，我们观察了复方银翘散对五种临床常见耐药菌株的抑制作用及敏感性，以期为临床抗细菌感染治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 分离自我院临床送检标本并经实验室确认的ESBLs(+)大肠埃希菌菌株30株，ESBLs(-)大肠埃希菌菌株30株，MRSA菌株30株，甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株30株，泛耐药铜绿假单胞菌30株(剔除同一患者相同部位的重复菌株);全自动微生物鉴定仪，JEM-1200EX电 镜;质 控 菌 株 为 ATCC25922、ATCC25923、ATCC27853;琼脂，ESBLs确诊纸片，头孢西丁纸片;复方银翘散原药。

1.2 复方银翘散药液制备 称取连翘15 g、双花15 g、桔梗9 g、薄荷9 g、竹叶6 g、生甘草8 g、荆芥穗6 g、淡豆豉8 g、牛子9 g，加水适量(以浸过药材1～2cm为宜)浸泡10min，文火煮开20min后倒出药液，过滤，分装，高压灭菌备用。用前将定量药液称重、干燥，计算药物浓度，并采用二倍稀释法分别配制供试药液，根据要求加入M-H琼脂，倾注平板［2］。

1.3 菌液制备及复方银翘散抑菌作用检测 常规培养上述五种菌株，挑取培养18～24 h的纯菌落，制成0.5麦氏单位，浓度相当于(1～1.5)×108cfu/ml的菌悬液，备用。将1.2中每个平板分成若干份，编号。取10 μl菌悬液按编号加至平板表面，35℃培养，记录24 h内细菌超微结构变化;以48 h无菌生长之最低药物浓度为复方银翘散最低抑菌浓度(MIC)。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计学处理。计量资料采用±s表示，组间比较行t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 细菌超微结构 复方银翘散作用前MRSA和MSSA菌株形态完整，胞体光滑无缺损，内部结构清晰;作用后菌株大小不一，细胞壁缺损，胞质膜层次不分明，部分细胞质内含物消失，细胞质内包含体和染色体模糊不清。复方银翘散作用前大肠埃希菌结构完整，胞体均匀光滑，胞质充盈无溢出;作用后细菌胞体膨大、形态不规则，细胞质内包含体和染色体结构破坏严重，胞膜与胞质分离，细胞质内含物大量流失甚至成空泡。因实验条件所限，泛耐药铜绿假单胞菌超微结构变化未观察。

2.2 复方银翘散对五种菌株的MIC 复方银翘散的MIC在金黄色葡萄球菌＞泛耐药铜绿假单胞菌＞大肠埃希菌，见表1。

3 讨论

ESBL(+)大肠埃希菌和MRSA是目前临床上最常见的感染菌，而近几年陆续出现的大量泛耐药铜绿假单胞菌和鲍氏不动杆菌严重影响了临床抗感染治疗。中药治疗是我国传统医学的一部分，其与抗生素类药物相比抑菌效果弱，但具有全面调理作用，且对细菌不易产生耐药性。体外抑菌作用研究显示，中药抑菌机制主要有三个方面:①干扰微生物酶系，破坏其正常的新陈代谢，抑制酶活性。②使微生物蛋白酶凝固和变性，干扰其生存和繁殖。③改变细胞膜通透性，使其酶类和代谢产物逸出而失活［3］。复方银翘散是具有清热解毒、辛凉解表作用的复方中药代表方，多数文献资料中对其实验药液的终质量浓度以1mg/ml生药计，此在实际的操作中很难掌握，其加水量、浸泡时间、煎煮时间可直接影响药液浓度，故不同学者之间的研究无法横向比较，对临床的指导作用显著降低。本研究将复方银翘散药液浓度进行了定量，有利于实验的标准化、规范化，更具科学性和推广性;结果显示，复方银翘散对五种菌株均有较强的抑菌作用，其中金黄色葡萄球菌＞泛耐药铜绿假单胞菌＞大肠埃希菌;且对于金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌，无论是否产酶抑菌作用相似。本研究还显示，金黄色葡萄球菌经复方银翘散作用后细胞壁缺损严重，但大多数细菌内含物无流失，说明细胞膜尚完整，因此造成细菌死亡的原因可能与破坏细胞壁合成有关;而作用后的大肠埃希菌胞体膨大，细胞质内包含体和染色体结构破坏严重，胞膜与胞质分离，细胞内含物大量流失甚至成空泡，说明细菌不仅细胞壁破坏，细胞膜通透性亦发生改变，致使体内酶类和代谢产物逸出导致死亡。至于具体是复方银翘散中何种有效成分使细菌失去活性尚有待深入研究。

表1 复方银翘散对五种菌株的MIC(±s)

表1 复方银翘散对五种菌株的MIC(±s)

注:与MRSA及MSSA比较，*P＜0.01;与泛耐药铜绿假单胞菌比较，#P＜0.01

菌株 MIC(mg/ml) t值 P值大肠埃希菌ESBL(+) 74.67±34.99*#-1.022 0.315 ESBL(-) 82.13±34.32*#金黄色葡萄球菌MRSA 27.73±20.64 MSSA 21.33±19.58 1.454 0.157泛耐药铜绿假单胞菌 43.73±15.68*

综上所述，复方银翘散对金黄色葡萄球菌、泛耐药铜绿假单胞菌、大肠埃希菌均有较强的抑制作用，机制可能为破坏细菌细胞壁、细胞膜及细胞内含物等。

［1］汪复，朱德妹，胡付品，等.2009中国CHINET细菌耐性监测［J］.中国感染与化疗杂志，2010，10(5):325-334.

［2］刘玉庆，李晔，车程川，等.大肠杆菌对中草药敏感性试验及其方法研究［J］.中兽医医药杂志，2003，22(1):3-5.

［3］何明，张永跟.中药抑菌作用现状［J］.北京中医药大学学报(中医临床版)，2007，14(6):44-46.