多胚亚麻种质的研究与利用

康庆华 ，关凤芝 *，吴广文 ，徐 涵 ，黄文功 ，刘 岩 ，孙中义 ，张利国 ，吴建忠 ，姜卫东，赵东升 ，程丽丽，宋喜霞

（1.黑龙江省农业科学院经济作物研究所，哈尔滨150086；2.法国图卢兹综合科学研究所，法国；3.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨150086）

亚麻科有22个属200多个种，生产上应用的为栽培种亚麻（Linum usitatissimum L.），该种内有极少部分种质资源存在多胚性，称为多胚亚麻，即在亚麻种子的一个胚珠中包含两个或多个胚。早在1933年Kappert就对多胚亚麻进行了研究，以后的大量文献认为单倍体植株的出现频率在双胞胎中显著高于非双生植株，并且在种子发芽后3-5d很容易鉴定，所以，利用多胚亚麻种质资源作为单倍体的来源，成为亚麻育种的一个新方法。

1 多胚亚麻种质的引进与系选

1.1 多胚种质引进

俄罗斯是世界上开展亚麻多胚种质资源研究和利用最早的国家。自20世纪70年代起，全俄亚麻研究所的Poliakov和他的同事（2010）对亚麻纤维型、中间型和油用型三个类别的125（个样本）份种质的600 000个种子进行了海选和分析，筛选到208(0.034%)个能获得双生植株的种子，4个（0.0006%）获得三株植株的种子，多胚率0.034%，且中间型和油用型概率更高。还认为多胚种子的形成在一定程度上取决于基因型。筛选出 Садко、1288-12（俄罗斯）、Lintekx（加拿大）、Ninke（荷兰）、Minerva、Cristal（美国）等具多胚的特征、双生幼苗率0.05%～0.6%的种质材料，而Светоч，Лазурный，Торжокский4（俄罗斯），к-7222，Тайга（法国）等材料的样本数达到 10 000～16 000，才能发现双生植物。后来育种者们利用这些材料通过杂交、物理化学等方法进行了研究和利用，创造出一系列高多胚率的种质材料和加倍单倍体品系。1993年，黑龙江省农业科学院经济作物研究所从俄罗斯农业科学院全俄亚麻研究所引入了3份多胚资源（D95029、D95030和D95031），开始了中国多胚亚麻种质资源和育种的研究。

1.2 多胚种质系选与多胚性保持

1994年，我所对3份引进资源进行了繁殖和多胚性鉴定。在起初的繁殖阶段采用种子混收，由于这3份资源不是纯系，多胚水平明显下降，迄今在D95030和D95031中每10 000粒种子中，尚未发现多胚种子。为了保持和提高D95029的多胚水平，自2002年开始对其进行了连续的多胚单株的系统选择，目前已选出在株高、纤维含量及多胚水平等性状表现不同的株系19个。品系选择对该资源多胚水平的保持和提高以及今后的利用具有重要意义。

2 多胚亚麻种质的创新

杂交可以促进多胚现象在不同基因型间联合、集中和扩展。刘燕（1999）利用3份引进的资源与具有不同遗传基础的资源杂交，H0代多胚检测结果显示，以D95029为母本的4个组合后代双胚率为19.2%，以D95030为母本的3个组合后代的双胚率为5.3%，以D95031为母本的3个组合后代的双胚率为1.3%。随后我所利用已系选的多胚资源，采用与几乎不具有多胚性的材料以广泛杂交的方式对引进的多胚资源进行改良和推广，发现多胚率最高的一个组合H09052，F1代多胚率达50%。表1为2002年至2009年利用引进的多胚资源所创造的亚麻育种材料的多胚情况。在多胚资源利用期间，还进行了其双生植株的形态学、细胞学和分子生物学上的研究。

表1 2002-2009年亚麻创新资源的多胚率Tab.1 Polyembryonic rate of the hybridized strains from 2002 to 2009

2.1 双生亚麻植株的形态观察

据俄罗斯的大量研究报道，多胚种子中形成的双生植物，具有下列的组合，即单倍体－单倍体（n-n）、2n-n、2n-2n型双胚，三胚、四胚很少见。2008年我所对15个样本110个多胚种子的31对未死亡的多胚植株进行了形态观察，发现大多双生苗中的大苗为二倍体可育，小苗为单倍体苗不能结实；有的双生苗大小株型完全相同，但育性不同，有的大株不育小株可育；有的孪生株株高相同茎粗不同育性也不同，且都为2n－n型。有的双株都可育，为2n－2n型。也有上述多种情况出现在同一组合内的。既有二倍体-单倍体组合，也有二倍体-二倍体组合。在这31对双生植株中未发现单倍体-单倍体组合。这31对双生苗中出现26株单倍体苗，单倍体苗在双生苗中出现的频率为41.9%。

2.2 双胚亚麻的细胞学和分子生物学研究

目前，多胚亚麻的细胞学研究很少。我所以多胚亚麻材料D95029-18-3、D95029-8-3、D95029-8-1、1-6Ha的8粒双胚种子形成的16株苗（以大、小区分每粒种子的2株苗）的根尖为检测部位，采用醋酸洋红和DAPI进行染色体倍性观察，发现D95029-18-3的第12号种子形成的小苗、1-6Ha的第23号种子形成的小苗的染色体为16条，为单倍体；观察到D95029-8-1的21号种子形成的小苗、D95029-8-3的1号种子形成的大苗染色体在32条，鉴定为二倍体；其余苗没有查到能鉴定出倍性的分裂相。通过对染色体的数目的检测进一步证明双生苗中单倍体苗的存在。

目前有关亚麻多胚的分子生物学研究很少。本人从随机选择的70条RAPD引物和21条ISSR引物中筛选出的10条引物对品系1-6ha-3中的多胚种质材料和其它23个不具多胚性的亚麻材料进行聚类分析，试验结果显示24份亚麻材料（见表2）在阈值为0.73处能被分为四大类，多胚材料1-6ha-3独为第二类群，且与其他23个亚麻品种的遗传相似系数分布在0.6522～0.7739之间（图1），表明这份种质材料与其他材料间都存在着较大的遗传差异，为亚麻多胚性分子标记的研究奠定了基础。

表2 供试的24份亚麻材料Tab.2 24 materials of Linum usitatissmum L.for the experience

图1 24个亚麻栽培品种的聚类分析Fig.4 Clustering analysis diagram of 24 cultivars of Linum usitatissmum L.

3 多胚亚麻遗传、诱导和利用

3.1 亚麻多胚性的遗传研究

多胚性是受基因控制的，因此可以遗传。以往的研究资料表明多胚性是受多基因控制，因此俄罗斯进行多胚遗传研究时在杂交后代中发现了多胚遗传的中间型。也有一些试验还发现基因的加性效应影响着多胚现象的显现。还有资料研究认为多胚的遗传同时受细胞质和细胞核的密切作用影响（Poliakov，2010）。因此多胚性的遗传比较复杂，有待进一步研究。

在我们的试验中，对2006年的21个诱导多胚的杂交组合的F1和F2代进行了多胚检测，发现16个组合F2代多胚率高于F1代，5个组合F1代高于F2代。该试验关于多胚出现的概率在F1和F2代的变化情况与俄罗斯的研究结果不一致。

在被研究的21个杂交组合中，在H06127、H06140等的8个杂交组合F1和F2代中多胚出现率比其父母本具有明显的优势，其它组合则出现中间性遗传。导致第一代中多胚增加的原因目前还未能明确。但值得一提的是在种内杂交的F1代种子双生植物出现的频率增加和伴随着单倍体-二倍体植株形成的多胚种子明显增加的现象，对于在育种实践中的应用具有重要意义。如，在H06128的杂交组合的F1代杂交种中发现了4对双生植株，其中3对具有二倍体-单倍体组合组成；H06127的杂交组合的F1代杂交种中发现了14对双生植株，其中10对具有二倍体-单倍体组合组成。所以在选择这样的杂交组合过程中在F1代种子中即可得到大量的单倍体植株。

3.2 多胚的诱导研究

目前关于多胚诱导方面的国内研究资料极其有限。在亚麻方面我们主要是开展了选定的特定基因型间的杂交试验研究。

3.2.1 杂交诱导多胚

根据上面的研究，不难发现采用多胚率高的材料与无多胚性和多胚性极低的材料杂交，其后代在多胚性上很可能出现超亲优势或出现多胚中间型。因此利用杂交是诱导多胚提高多胚率的有效方法。在研究中我们配置了能够诱导出多胚的杂交组合500个，既这些杂交组合的亲本至少有一个是具有多胚特性的材料。试验中我们得到了500多个杂交材料。通过分析杂交后代材料的多胚水平可知，以高多胚率的材料无论作父本还是母本，杂交后代都可能出现多胚现象，且亲本的多胚水平越高，杂交后代的多胚出现的机率越大；杂交双亲都是具有高多胚率的材料，其杂交后代的多胚水平将明显增加（见表3～表5）。从多胚性高的杂交后代中分离出一系列品系如H99007、H04052等，以组合的亲本（母本或父本）形式与非多胚种子进行杂交试验发现，利用这些品系中的无论非多胚种子还是多胚的种子做亲本（父本或母本）的杂交后代也都有多胚现象发生，但以多胚种子做亲本的组合后代多胚发生频率高，这与俄罗斯的研究结果一致。

表3 母本属于多胚种质的杂交组合后代中的多胚现象Tab.3 The polyembryonic Ratio of the polyembryonic female parental hybrid seeds

表4 父本属于多胚种质的杂交组合后代中的多胚现象Tab.4 The polyembryonic Ratio of the polyembryonic male parental hybrid seeds

表5 双亲都属于多胚种质的杂交组合后代中的多胚现象Tab.5 The polyembryonic Ratio of the polyembryonic parental hybrid seeds

3.2.2 外在因素诱导多胚

由于个别基因型的多胚发生情况在年际间表现相对不稳定。所以外部条件对多胚诱导具有一定的影响。在我们的研究中，采用NAA喷施多胚材料，结果发现有使多胚现象增加的趋势，该研究还有待进一步探索。

4 多胚亚麻育种存在的问题及建议

4.1 多胚性的保持

由前所述，多胚种质资源在连续繁殖过程中，如果不注重保持和选择，多胚水平将急速下降，多胚性将丢失。所以在多胚资源利用的同时，应加强多胚性的保持。在保持多胚方面应做好以下三个方面的工作：一是不断地进行筛选；二是不断进行杂交诱导；三是探索提高多胚率的外界因素。

4.2 多胚的基础性研究

目前，有关多胚资源的基础研究工作还相当薄弱。多胚的基础研究是多胚资源利用的关键。所以有待进一步加强。一是要深入开展多胚胚胎发生学研究，为更好利用多胚提供理论基础；二是要加深多胚的遗传学和分子生物学研究，以明确多胚遗传规律和形成机理，为高效利用多胚资源提供保障。

4.3 多胚亚麻的创新利用

目前我们虽然已经创建了一定的多胚亚麻资源基础，但应加快多胚资源的创新利用步伐。尤其是利用多胚双生植株中的单倍体获得的双单倍体品系技术应常规化应用于亚麻育种，以达到快速固定杂种优势的目的，提高资源创新和育种效率。

Poliakov.亚麻生物育种技术[M].莫斯科,2010.

刘燕.多胚性亚麻种子的单倍体育种技术[J].中国麻作，1999,21（3）:19-20.

康庆华.双胚亚麻（Linum usitatissmum L.）利用的研究[J].中国麻作,2004,26(3):110-113.

康庆华，等.亚麻单倍体抗逆基因的转化[J].中国麻业科学,2006,28(6):291-296.

康庆华,徐涵，等.利用亚麻多胚性状建立单倍体群体并实现离体扩繁[J].农业生物技术学报,2007,15(增刊):249-252.

康庆华，等.应用分子标记探讨多胚亚麻的分类地位[J].中国麻业科学,2010,32(4):84-88,98.