亚麻再生体系建立与遗传转化研究进展

贾婉琪，王玉富，郝冬梅，邱财生，郭 媛，邓 欣，龙松华，陈信波

（中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205）

植物遗传转化是一项农业生物技术，它利用重组DNA与植物组织培养技术将外源基因导入植物受体细胞进行无性繁殖，使外源基因在受体细胞表达，从而产生人类所需性状的转基因植株。亚麻作为纺织原料和食用油已经具有悠久的历史，而亚麻种子作为保健食品及医药的深度开发刚刚开始，同时我国亚麻纤维又严重短缺，亚麻产业的研究与发展具有广阔的前景。

由于在育种中长期使用同一些骨干近缘亲本，造成现有品种遗传基础狭窄，仅依靠传统育种手段已无法满足对优良品种的需求，基因工程则为培育优良品种开辟了新途径，其中研究最清楚和应用最成功的是农杆菌介导的遗传转化，在已获得的近200种转基因植物中约80%是由农杆菌介导完成的[1]。亚麻转基因始于20世纪80年代，1983年Hepburn等用根癌农杆菌感染亚麻上胚轴得到亚麻肿瘤株系，自此开始了亚麻基因工程的育种研究[2]。1987年Nazir Basiran等报道利用农杆菌介导法首次获得了亚麻转基因植株。但亚麻在这方面存在着基因转化率较低，基因型依赖性强，再生细胞部位与转化感受态细胞部位不一致等亟待解决的问题。对此，笔者对亚麻再生体系的建立、农杆菌介导法在亚麻育种上的应用现状进行了阐述和展望。

1 亚麻再生体系影响因素的研究

建立高效组织培养体系是植物遗传转化的先决条件。从理论上说，植物细胞具有全能性，每一个具有完整细胞核的植物细胞，在适宜的条件下都有分化发育成完整植株的潜力。但在实际应用中，亚麻组织的再生受基因型、外植体、培养条件等因素的影响，机制比较复杂。

1.1 最佳外植体的选择

1.1.1 外植体的基因型

农杆菌介导的外源基因的遗传转化很大程度上受到外植体基因型的影响。是否具有脱分化和再分化能力，能够产生创伤信号分子刺激农杆菌向植物细胞运动，并使农杆菌vir基因活化和表达等，都和植物的基因型有直接关系。

姬妍茹等[14]以双亚五号和双亚七号为试验材料进行组织培养，在完全空白对照中，亚麻下胚轴的分化率高达89.1%和93.6%；而经农杆菌处理后，其分化率表现出较大差异，双亚五号分化率最高能够达到23.4%，双亚七号仅为5.56%。在Caillot等[5]的研究中，愈伤组织诱导培养基相同，品种Barbara和Oliver的愈伤诱导率却有明显差异，分别为52.3%和93%。同样Belonogova和Raldugina[4]在以萌发5天的亚麻子叶作为外植体的高频再生体系的研究中发现，品种A-29的不定芽分化频率是Alexim的三倍。

1.1.2 无菌苗的获得

获得无菌苗和相应的外植体是建立离体再生系统的第一步，在有关亚麻的文献中，对亚麻的消毒方法也是大同小异。姬妍茹等[40]在用组织培养法繁殖野生亚麻时，将野生亚麻种子播于花盆，待幼苗长至20cm具有很多分枝后，取3cm的小分枝，用0.2%NaClO灭菌5min。

在亚麻种子消毒方面，国外研究者[3～11]多采用含次氯酸钠的漂白剂浸泡20min～40min以达到对亚麻种子消毒的目的。在一定范围内，随着漂白剂使用浓度和温度的提高，亚麻下胚轴外植体的再生能力、实生苗的生存和生长能力是逐渐降低的，最佳的消毒方法是在10℃下使用浓度为40%的漂白剂（含5%NaClO）浸泡20min[12]。国内研究者常采用的是短时间的乙醇消毒和长时间的升汞消毒，70%～75%乙醇消毒30s～5min后用0.1%升汞消毒3min～15min。笔者在试验中也发现，不同品种亚麻所需要的消毒时间有很大差异，这可能与其带菌程度不同有关，为保证种子出苗率，应在彻底消毒的基础上尽量缩短升汞浸泡时间。不论使用何种消毒试剂，消毒后都必须用无菌水进行充分的漂洗。

1.1.3 苗龄

外植体的取材也是影响组培成功的关键因素，一般情况下，春季接种的实生苗其生活能力和再生能力都比较好。焦德志等[35]培养双亚6号时，切取苗龄15天的实生苗的子叶和下胚轴作为外植体。Belonogova和Raldugina[4]在试验中发现采用萌发5天的亚麻子叶作为外植体其分化与再生能力要远高于萌发8天之后的。

对于最常用的外植体--下胚轴的取材时间，张志扬等[34]发现随着苗龄的增加，其不定芽诱导率和平均出芽数呈下降趋势，7～10天苗龄的下胚轴最适于不定芽的诱导，诱导率达91%～97%，平均出芽数达11.43个，是取材的最佳时期。这一结果与Yildiz和Özgen[3]、Beranová等[21]、康庆华等[24]、王毓美等[28]的试验结果是一致的。

1.1.4 外植体类型

在已报道的亚麻组织培养相关文献中，主要选择的外植体有，子叶、下胚轴、茎尖、花粉等。焦德志等[35]将实生苗上切取的子叶（去掉基部）和下胚轴（0.8cm）进行了比较，结果显示子叶诱导愈伤组织比下胚轴快；培养10天后子叶周围开始形成愈伤，而下胚轴通常在一端形成较多的愈伤组织，表现出一定的极性和不平衡性。姬妍茹等[14]的试验结果表明，外植体培养一周的成活率由高到低的顺序为子叶块、下胚轴段、茎尖。子叶块虽然有着最高的GUS瞬时表达率和成活率，但经农杆菌处理后其分化频率极低；茎尖的分化率也较低，而下胚轴分化率较高，因此后续试验中将下胚轴作为转化的外植体。胚轴的不同部位分化率也不同，Ishikawa等[39]将萌发后的亚麻种子幼苗去掉顶端的胚轴分成上中下三部分，统计其不定芽分化率分别为10%、30%、60%。

下胚轴作为转化时最常用的外植体，具有在切断或胁迫条件下形成不定芽的独特能力（在下胚轴切段的整个表皮细胞都产生不定芽）。而转化细胞通常只在两端的创口处产生，因此在遗传转化时形成过多的嵌合芽是下胚轴作为外植体的缺点[4]。

1.1.5 预处理

Zhan等[17]在研究中发现增加表皮创伤有助于转化、能够促进愈伤的形成但却抑制芽的分化。Dong和McHughen[7]将下胚轴剥皮处理再预培养2～3天，经过农杆菌浸染、共培养后对其进行GUS染色，发现下胚轴表面被转化组织覆盖的区域与对照相比有明显增加。Yildiz和Özgen[3]将三个不同亚麻品种的下胚轴转入培养基之前先用无菌水浸泡20min，结果显示在后期培养中外植体的干重、鲜重、不定芽分化率、生根率等与未作水处理的相比都有显著的提高。

1.2 培养基

培养基是外植体赖以生长的物质基础，不同组分的培养基和不同比例激素的添加都会产生不同的效果。笔者对国内外亚麻再生系统的培养基做了如下统计，以供今后的相关研究进行参考。

表1 亚麻组织培养再生体系培养基的研究Tab.1 The research on the mediumofregeneration systemin flaxtissue culture

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此外，王玉富等[23]在利用农杆菌介导法进行亚麻转基因的培养基研究中发现，作为基本培养基B5培养基与MS培养基相比更不利于脱菌。

培养基中添加不同的凝固剂对筛选剂卡那霉素的应用效果也不同。在亚麻组织培养中，外植体在植物凝胶（Phytagel）中的生长状态要优于琼脂凝胶（Agargel）优于琼脂（Bacto Agar）。因此在遗传转化中使用琼脂作为凝固剂时50mg/l的卡那霉素即可发挥筛选抗性愈伤的作用，使用琼脂凝胶要添加100mg/l的卡那霉素，而植物凝胶需200mg/l的卡那霉素才能达到筛选的目的[36]。

很多文献中报道，培养基中加入活性炭对培养物的生长分化有促进作用，它可以吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质。张志扬[41]在研究中发现，在不定芽诱导过程中添加1.5g/l的活性炭，可提高健康不定芽的诱导频率，但在生根时添加活性炭却得到相反的效果。王秀珍[32]建议活性炭的用量在0.5%～3%之间，因为使用量过高会削弱琼脂的凝固力。

1.3 光强

Caillot等[5]专门对光照的影响做了研究，培养初期使用HL（高光强）能显著提高下胚轴两端切口处愈伤的形成能力和器官分化能力，而且还对愈伤分化出芽有积极的作用，在此条件下每个愈伤分化出2.7个抗性不定芽，相对的在LL（低光强）下只有1.9个不定芽产生。

2 农杆菌介导的亚麻遗传转化的研究

已用于亚麻遗传转化的外源基因有：胭脂碱合成酶基因(nos)、新霉素磷酸转移酶Ⅱ基因（npt-Ⅱ)、乙酰乳酸合成酶基因（als）、5烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因（epsps）、β-葡糖醛酸酶基因（gus）、潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）、壮观霉素抗性基因（aadA)、磷酸甘露糖异构酶基因（pmi）、绿色荧光蛋白基因（gfp)、几丁质酶基因（rc24）、兔防御素基因(np-Ⅰ)、β-1，3-葡聚糖基因及L6、M、N锈病抗性基因、bar基因等。

与其它方法相比，农杆菌转化系统具有操作简便、不需特殊的仪器、培养周期较短等特点，更重要的是农杆菌介导法转入的基因经常是单拷贝，因而表达水平高，并且可以转入大的DNA片段，因此对于大多数植物的转化工作而言是首先考虑的方法。

2.1 农杆菌种类对转化的影响

遗传转化中常用的农杆菌菌株主要分为3种不同类型，章鱼碱型（如LBA4404）、胭脂碱型（如C58）和农杆碱型（如EHA105)。在通常的遗传转化操作中，胭脂碱型和农杆碱型因易于操作而常被作为首选[13]。在亚麻上应用过的菌株有 AGL1[14,15]、GV3850[6]、A208[8]、GV3101[5,9,11,15]、PGV2260[16]、C58C1[7,10,17,18]、LBA4404[6,19,20～22]和EHA105[23,24]等。张志扬[41]将两种农杆菌菌株对亚麻白花品种的侵染效果做了比较，结果显示，EHA105浸染后的愈伤诱导率和抗性不定芽诱导率明显高于LBA4404。农杆菌菌株的浸染能力在应用于不同类型植株时有很大差异，因而不同的作物种类在实际操作过程中存在最合适或最敏感菌株，选择受体植物敏感的菌株是转化成功的重要因素。

2.2 浸染浓度与浸染时间对转化的影响

农杆菌菌液浓度过低会因外植体上附着的菌体较少而降低农杆菌的侵入，浓度过高又会对外植体造成伤害，且在后续培养中很难控制农杆菌的污染；浸染时间长短对外植体的影响也是如此。因此对于不同的亚麻品种筛选出最优浸染浓度与浸染时间方案是提高转化频率的关键。姬妍茹等[14]、王玉富等[23]、康庆华等[24]及Bretagne-Sagnard等[25]在试验中均采用OD600=0.5的菌液，但浸染时间有所不同，分别为3～5min、10～20min、30min和1h。国外研究者采用OD600=0.4～0.8，浸染时间2h的居多[5,21]；但亦有浸染时间仅为5秒的[27]。张志扬[41]对不同浓度菌液的浸染效率做了比较，结果显示OD600=0.6、浸染时间为30min时，亚麻抗性不定芽诱导率达到26.67%，远高于其他组合。

2.3 预培养对转化的影响

一般认为，在农杆菌浸染前对外植体进行一段时间的预培养，可以减轻伤害胁迫，调整细胞生理状态，促进细胞分裂，更易整合外源DNA，有利于提高转化效率。还有研究认为预培养提高转化效率另一方面的原因是可以便于外植体伤口酚类物质的释放和积累，这种酚类物质可促进农杆菌介导的转化。但预培养时间过长会使伤口愈合，反而不利于T-DNA转移进入细胞。

姬妍茹等[14]在研究中发现，预培养与否直接影响着受体的一周成活率，外植体下胚轴和子叶的GUS瞬时表达率在预培养2天后开始出现下降趋势，不进行预培养虽然有100%的GUS瞬时表达，但外植体生长状态不佳，成活率低，难于进行再分化。在Dong和McHughen[7]的试验研究中发现未经过预培养的下胚轴切口两端有较强的染色效果，预培养时间超过6天的染色强度反而降低。Bretagne-Sagnard和Chupeau[25]在GUS染色试验的结果中发现，预培养和剥皮同样能够使瞬时转化率提高；剥皮处理后，蓝色表达细胞不止在两端，还在整个受创表皮出现，但最终获得的转化率并没有提高，依然为15%。

2.4 共培养时间对转化的影响

共培养是T-DNA转移到植物细胞的过程，共培养时间的长短关系到T-DNA片段向细胞内转移的过程是否能够完成，前人研究表明，T-DNA向植物细胞内的转移需要16～24h，因此共培养时间至少应在1天以上。在亚麻转化过程中最常用的共培养时间为2～4天[5,6,8,9,14,16,18,21～23,25～29]。Dong和McHughen[7]将共培养时间从2～3天延长到5～7天，检测GUS基因的瞬时表达，发现转化频率有很大程度的提高，转化细胞的分布范围也扩大了。张志扬[41]在试验中比较了不同共培养时间对转化的影响，结果显示，随共培养时间的延长，转化频率升高，但共培养超过72h后，农杆菌的过度增殖给下胚轴带来的毒害作用也增强，污染的下胚轴数增加，综合考虑96h为最佳共培养时间。针对不同的研究，具体共培养时间依品种基因型和菌液浓度等而定。

2.5 乙酰丁香酮与芥子酸对转化的影响

乙酰丁香酮（AS）是农杆菌寄主植物受伤后分泌的酚类化合物之一，其作用是活化Ti质粒 Vir区基因，是促进T-DNA转移的关键因素。康庆华等[24]认为菌液中添加50mg/l的AS即可。王毓美等[28]在试验中向摇好的农杆菌菌液中添加100mg/l AS后继续振荡培养12～16h，然后再浸染下胚轴，这与李学宝等[16]、袁朝兴等[19]的研究结果相同。

Zhan等[17]向培养基中添加100～200μM芥子酸（sinapinic acid），目的同样是活化Ti质粒Vir区，最大程度的提高转化效率，使没有创口的表皮细胞也可以被转化，但结果显示最终转化率并没有明显变化。

2.6 选择标记

筛选剂是准确、有效的区分转化与非转化细胞的必不可少的条件，其种类及使用浓度需通过研究具体确定。在进行亚麻的遗传转化时，选择抗生素使用较多的是卡那霉素，使用浓度在50～200mg/l之间[10,16,17,19,21,22,24,28～31]；潮霉素的使用范围在 30～50mg/l[9,15,26,31]；庆大霉素 50mg/l[32]；巴龙霉素100mg/l[5]；G418 50mg/l[5]；壮观霉素 40mg/l[15]。

Bretagne-Sagnard和Chupeau[25]对亚麻遗传转化时筛选抗生素的应用效果做了比较，同一处理下卡那霉素100mg/l、G418 100mg/l、巴龙霉素200mg/l的筛选效果相同；壮观霉素使用浓度在100mg/l时外植体表面依然有芽的分化，但全部为漂白色，当浓度达到400mg/l以上时则完全不能分化出芽。抗生素的选择不仅与外植体的基因型有关，还受农杆菌菌株类型和外植体生长阶段不同的影响，在与农杆菌C58C1共培养下，巴龙霉素和G418筛选的外植体不能形成不定芽，卡那霉素筛选虽然可产生不定芽，但无法诱导生根；与AGL1菌株共培养，在下胚轴两端切口处产生抗性不定芽，在壮观霉素浓度为100mg/l时抗性芽可生根。

除抗生素外，还有研究者使用草甘膦（gly）1μM[8]，氯磺隆（chlorsulfuron）400nM[18]作为筛选剂。Lamblin等[11]用农杆菌介导法将磷酸甘露糖异构酶基因（PMI）转入亚麻品种Barbara中，初选时用10g/l甘露糖+20g/l蔗糖代替30g/l蔗糖，继代和生根时用附加2.5g/l甘露糖的培养基筛选，最终获得了转基因植株。

2.7 农杆菌抑菌剂

选择适宜的能在受体材料与农杆菌共培养之后抑制农杆菌生长的除菌抑制剂也是农杆菌介导遗传转化的重要步骤。最适宜的浓度为既要有效控制农杆菌过度生长又要对转化体的抑制作用最小。亚麻上常用的除菌抗生素有Cef(头孢类）、Amp（氨苄类）、Carb（羧苄类）和Timentin（克拉维酸），这些抗生素对农杆菌都有杀菌和抑制的作用，对植物细胞也有一定的生物效应，通常在浓度为500mg/l以下时对外植体的生长和分化没有明显的影响，亦是最常使用的浓度[5,6,9,11,17,19,26,28]。也有两种抗生素混用达到较好抑菌效果的报道[8,16,18,21,27,29]。康庆华等[24]在亚麻转基因抗生素效果的研究中发现，在选择培养基内加入500mg/l克拉维酸钾和200mg/l头孢噻肟（进口）的抗菌素来取代500mg/l头孢噻肟（国产）不仅脱菌效果彻底“期效长”且不影响亚麻愈伤形成和芽的分化。姬妍茹等[42]发现在抑制农杆菌菌株AGL1时，头孢塞污钠效果最好，头孢曲松钠次之，有效抑菌浓度分别为200mg/l和300mg/l，此浓度下双亚5号下胚轴不定芽分化率分别为93.6%和91.3%。

3 存在的问题与展望

经过多年的研究，在亚麻的组织培养和遗传转化方面已经取得了令人鼓舞的成绩。亚麻组织培养再生体系已经比较完善，但并不是所有的组培再生体系都适合做遗传转化体系，良好的基因转化受体系统应具有高效稳定的再生能力。贾士荣[33]认为，用于转化的受体系统应具有80%～90%以上的再生频率，并且每个外植体上必须再生丛生芽，且芽数量越多越好，这样才有获得高频转化的可能；此外还需具有稳定的外植体来源，即用于转化的受体要易于得到，且可大量供应。由此可见，以亚麻下胚轴为外植体建立的再生系统是较理想的遗传转化受体系统。但亚麻下胚轴具有在胁迫或切断时在整个表皮都形成不定芽的独特能力，而转化细胞通常只在两端的创口处产生，因此在遗传转化时形成过多的嵌合芽是下胚轴作为外植体的缺点[4]。如何在提高抗性丛生芽数量的基础上减少无用嵌合芽的产生，是亚麻再生体系今后需要重点研究解决的问题。

在亚麻的遗传转化方面，主要问题是转化率低，外源基因表达强度不够，原因可能有以下几个方面：一是筛选剂加的太少或太迟，筛选时间不够，致使非转化细胞分裂分化；二是转化细胞的存活率较低，且这些仅有的少数转化细胞能够保护大量的非转化细胞，使之不受筛选剂的作用，导致分化出苗，发生“逃逸”现象；三是在长时间的转化和筛选培养过程中，亚麻对筛选剂产生抗性以及实验的污染等问题使转化率下降。因此仍然需要对转化体系进行深入研究。

相信随着植物遗传转化技术的不断成熟，这些问题将逐步得到解决。利用农杆菌介导的亚麻转基因体系必将在育种工作中发挥越来越重要的作用。

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