多胚苎麻的诱导及多胚性遗传分析

温 岚，喻春明，王延周，陈 平，陈继康，谭龙涛，熊和平

（中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205）

多胚作为一种特殊的生殖现象，对育种工作有着重要的意义[1]。苎麻的多胚现象于上世纪得到了证实[2]，获得多胚率高且稳定的品系是将多胚应用于育种的基础，也是研究作物多胚来源和机制的必要条件，经过育种工作者的努力，目前已经有不少作物被成功的诱导出用于研究多胚特性的品系。水稻是其中最成功的作物之一，其多胚品系已达数十个，以API-APIV为代表的材料多胚率最高达32.4%[3-5]。亚麻的多胚材料已经育成，并成功应用于杂种优势的固定和转基因育种[6-7]。经过几代育种工作者的努力，吉甜系列的多胚甜菜品种已达17个[8]。此外，延迟授粉已经成功应用于提高小麦多胚率[9-10]。近年来，本课题组加快了对苎麻多胚品系选育的研究，从近200个地方品种中初步筛选出15个多胚率高的地方品种，为了将多胚性加以稳定和延续，亟需创造新的高频多胚种质，并探明多胚遗传的机制。

被子植物多胚遗传机制已有比较详细的研究[11-14]，苎麻多胚性的遗传特性研究目前未见报道，为初步探索苎麻多胚的遗传特性，本试验首先对不同来源苎麻进行杂交和自交，获得多胚品系的同时，分析遗传特性；按照亲本选配的互补原则，选择多胚率差异明显的材料，设计两组正反交试验，分析后代多胚率差异的显著性。本研究通过延迟不同时间对苎麻授粉后分别测定多胚率，初步揭示延迟授粉对苎麻多胚率的影响。

1 材料和方法

1.1 多胚率的统计

在人工气候条件下进行纸床催芽，具体方法是：28℃湿润纸床（灭菌）催芽，1cm2摆放1粒种子，5d后进行观察，每个品种随机摆放1000粒种子，重复三次统计多胚率。多胚率=多胚种/发芽种

1.2 高频率多胚苎麻的诱导

在资源圃选择多胚率高或产量高的健康植株广泛杂交和自交，收获其后代测定多胚率。

1.3 正反交试验

第I组以中苎2号为亲本，分别与玉山麻等13个地方品种（系）正反交。

第II组以中苎1号为亲本，分别与靖西青麻等8个地方品种（系）正反交。

表1 杂交子代多胚率Table 1 The frequencies ofpolyembryonic seeds offilial generations

1.4 统计分析方法

同母本或同父本均值比较采用单样本t检验；自交后代与亲本间均值比较采用配对样本t检验；正反交结果之间均值比较采用配对样本t检验。

1.5 延迟授粉

以中苎2号为母本，开花前2～3天严格去雄后套袋，分别延迟1天、3天、5天和7天授以成熟期中苎1号花粉，与对照（不延迟）比较发芽率及多胚率。

2 结果和分析

2.1 杂交和自交F1代多胚率的检测

选择资源圃中长势最好的杂交材料或地方品系，设计近60组杂交组合，从33个组合（表1）收获了较多的种子，其中3组能产生较高多胚率，分别是：Z0663-1×中苎2号多胚率为9.3‰，Z0663-2×中苎2号多胚率8.9‰，Z0815×Z0814多胚率为7.8‰。

经过分析杂交组合所得后代的双胚率可发现以下规律：1、以T01-T08为亲本的杂交后代均无多胚现象；2、同母本杂交后代的双胚率十分接近，如中苎2号为母本的杂交后代多胚率都非常低，均接近0.5‰。3、同父本杂交后代的多胚率差异大，如Z0805为父本的杂交后代中，双胚率最高达3.68‰，最低只有0.27‰。

表2 自交后代多胚率Table 2 The frequencies ofpolyembryonic seeds ofinbred generations

21个自交种中，除S0811和S0813外，其余多胚率普遍极低(表2)。子代多胚率高于5‰的为S0922和S0924，多胚率分别为5.3‰和6.2‰,亲本分别是S0811和S0813。对亲本多胚率与子代多胚率进行配对样本t检验，所得P值为0.221，大于0.1，表明两样本均值无差异，部分材料的多胚率在亲代和子代中出现差异，为外部环境影响造成。

2.2 正反交差异的t检验

表3 正反交后代多胚率Table 3 The frequencies ofpolyembryonic seeds ofreciprocal crossed generations

从表3可以看出：1、沅江肉麻×中苎2号、圆叶青5号×中苎2号和靖西青麻×中苎1号的子代多胚率均高于5‰，其中多胚率最高的杂交组合为靖西青麻×中苎1号，多胚率高达8.5‰；2、两组多父本试验中，后代多胚率均值经t检验，P值分别为1.0和0.18，表明多父本产生后代的多胚率无显著差异；而两组多母本试验中，后代多胚率均值经t检验，P值分别为0和0.019，表明多母本产生后代的多胚率呈极显著差异；3、试验组I中正交后代与反交后代多胚率均值进行配对样本t检验，P值为0，表明正反交后代多胚率呈极显著差异；试验组II中正交后代与反交后代多胚率均值进行配对样本t检验，P值为0.015，在差异显著性0.05水平上，两者呈显著性差异。

图1 延迟杂交授粉对苎麻多胚诱发的作用Fig.1 Function of delayedpollination in inducing polyembryonic ramie seeds

图2 苎麻延迟授粉产生双胚苗Fig2 Twin-embryoramie seedlings induced bydelayed pollination

2.3 延迟杂交授粉对多胚率的影响

对中苎2号分时段延迟授粉后，发芽率和多胚率的变化如图1所示。在开花期杂交产生子代的发芽率为99.5%，多胚率与开放授粉的母本多胚率一致，表明人工处理对子房发育和受精过程无影响。延迟1天授粉，发芽率有所降低，由99.5%降至94.5%，多胚率无变化；延迟3天授粉，发芽率急剧下降至46.8%，但是可育种中多胚率却明显提高，由1.3‰提高至3.7‰，提高近3倍；延迟5天授粉，发芽率降至26.6%，延迟7天授粉发芽率为零。延迟授粉时间超过5天时，多胚率为零。图2为延迟3天授粉产生的双胚苗。

3 讨论

3.1 多胚遗传的特点及其对苎麻单倍体育种的意义

多胚现象在苎麻中广泛存在，从苎麻品种间进行杂交和的正反交试验结果来看，多胚遗传呈现明显的胞质效应。证据一，同一母本的杂交后代多胚率相同，而同一父本的杂交后代差异很大，多胚表现为母性遗传；证据二，正反交的结果呈现显著差异或极显著差异。这两点都能证明苎麻多胚遗传的细胞质效应。其他作物也有表明多胚属于胞质遗传，朱建清等对水稻多胚性遗传特点进行了研究，确定了水稻多胚性遗传的胞质效应，效应的大小与遗传背景有关[4,9,15-17]。

胞质遗传又称细胞质遗传，是指正常细胞质成分引起的遗传现象。广义的讲，细胞质遗传可以包括染色体遗传以外的任何细胞成分，如质体、线粒体等所引起的一切遗传现象，甚至由外来物质引起的遗传现象也包括在内。很多地方都用非染色体遗传这一概念来代替细胞质遗传这一较严格的定义。瑟伯（Serb）等1965年曾经例举出一系列鉴别细胞质遗传的标准，认为如果在试验中出现以下任何一种情形，就值得考虑有关的性状是属于细胞质遗传的：1、正交与反交的结果不同；2、表现母性遗传；3、不能在某一特定的染色体上找到相应的基因位点；4、两亲杂交后，子代自交或与亲本回交表现不分离现象；5、不遵循孟德尔分离定律；6、通过回交将母本的细胞核置换后，仍然表现母本性状[18]。按照这一标准，苎麻多胚性的遗传符合两项，因此我们确定苎麻多胚性属于胞质遗传。

细胞质遗传效应在育种中的应用首推雄性不育，培育理想的不育系。其次是核质互作，由于异源细胞质和细胞核的相互作用，常常产生一些异常特性，在这些特性中，对本研究而言最有意义的价值在于单倍体多发系统的利用。所谓单倍体多发系统是指通过将异源细胞质导入含有特定细胞核的细胞中，利用这种核质互作效应，可产生高频率的单倍体后代。这一特点在小麦单倍体育种中应用的最成功，研究者发现异源细胞质对染色体行为的影响，首先表现为远缘杂种染色体组的消失，如小麦与球茎大麦杂交时F1染色体组消失产生单倍体，这是由于原生质体融合产生的体细胞杂种出现染色体丢失而产生[19]。其次，异源细胞质直接诱导杂种产生单倍体，Kihara和Tsunewaki首次发现将普通小麦Salmon（1BL/1RS易位系）导入Ae.caudata细胞质时，核质杂交后代能产生约30%的单倍体及11%的双胚苗。此后一系列研究证明：C、Cu、Mu等七种类型细胞质的Salmon均能诱导单倍体和n-2n型双胚苗，这是由于1RS易位短臂上有一个诱导孤雌生殖的基因Ptg，Ptg基因与该类型细胞质互作能导致卵细胞独立成胚而产生单倍体[20]。

本研究的主要目的是获得单倍体植株，目前的方法是在多胚苗中筛选，随机性较大，该试验首次发现苎麻多胚具有胞质遗传效应。首先，对苎麻多胚育种具有重要意义，因为胞质遗传的最大特点之一是稳定性，我们可以直接利用高频率多胚品系作为亲本，这就缩小了育种材料选择范围；更重大的意义是有望开发苎麻的单倍体多发系统，寻找类似诱导小麦孤雌生殖的基因，以及能与其发生核质互作效应的胞质类型，诱发卵细胞成胚，最终培育出n-2n型多胚品种。

3.2 延迟授粉对多胚诱导的作用

一般而言开花期柱头受精能力最强，此时的柱头色泽鲜明，如果在这时授粉，结实率最高。授粉时间和受精时的条件对延迟授粉的结果有很大影响，不同作物具有受精能力的期限不同，禾谷类作物柱头在开花期1-2天即有受精能力，棉花柱头的受精能力只能维持到开花第二天，大豆则可维持2-3天。苎麻柱头的受精能力维持时间的研究尚未见报道,本试验对苎麻延迟授粉试验表明，中苎1号柱头受精能力维持的时间小于7天。

延迟授粉已被证明对小麦、天麻多胚发生具有促进作用，在天麻开花授粉的单果内，多胚率不超过1%，然而当授粉延迟3-4天时，单果内多胚种子的数目有显著增加，表明延迟授粉是有助于多胚形成的。延迟授粉天数对诱导效果影响最明显，用黑麦和硬粒小麦给普通小麦品种间杂种F1授粉，发现去雄后8天授粉诱导多胚效果最好[21-22]。本试验首次通过种间延迟授粉获得了高于对照2倍的多胚率，对多胚诱导提供了一条新的途径。今后将采用延迟授粉对不同品种多胚诱导的效果进行研究，并通过胚胎学手段观察去雄后成熟胚囊的变化，以探明延迟授粉诱导多胚形成的机制。

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