整体透明技术观察悬铃叶苎麻胚胎发育的方法研究

李彦坤，臧巩固，赵立宁，李育君，唐 蜻，程超华

（中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205）

整体透明技术作为研究植物组织内部结构的一种有效方法，近年来已经被广大科研工作者所熟悉，并越来越多的应用到各个科研领域。整体透明技术是用各种不同配比的透明剂来处理植物组织，处理后的材料中各个器官由于组成、颜色和厚度等存在差别，从而对光线的折射率不同，在微分干涉差(differential interference contrast，DIC)显微镜或相差显微镜下可以直接观察组织内部结构的方法[1]。在植物胚胎学的研究中，整体透明技术和其他传统的研究方法相比，存在显著的优势[2]。传统的石蜡切片和整体解剖等方法耗时长、效率低，并且要求操作的技术人员具有一定的经验，因而在某些研究领域内已经渐渐被整体透明技术所替代。最早的整体透明技术是Herr于1971年提出的[3，4]，所使用的透明剂被称为“Herr 41/2”，后来的许多透明剂都是在Herr 41/2透明剂的基础上改进而来。Crane在1978年使用水杨酸甲酯作透明剂，对于胚囊的透明度较“Herr 41/2”的透明效果更好[5]。本试验以悬铃叶苎麻的雌花为材料，运用整体透明技术观察其胚胎的发育[6，7]，并试验不同的固定液与透明剂组合对透明结果的影响，旨在摸索适合悬铃叶苎麻雌花的透明方法，并为快速判断雌花发育阶段提供理论依据和试验基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验选用中国农业科学院麻类研究所收集并保存的悬铃叶苎麻（Boehmeria tricuspis），取开花期的雌花组织作为试验材料。所用化学试剂为分析纯，用水为去离子水，观察用显微镜为北京泰克立体显微镜XTL-20和Olympus微分干涉差显微镜BX51TRF。

1.2 试验方法

悬铃叶苎麻雌花的整体透明技术分为固定、脱水、透明、镜检几个步骤，本试验选用4种固定液和3种透明液组合使用，旨在摸索适合悬铃叶苎麻的透明方法，并选取透明效果较好的组合深入试验，以期进一步改善透明效果并提高透明效率。不同固定液和透明液配方见表1。

1.2.1 固定

对开花期的悬铃叶苎麻雌花定期连续取材，取材后立即将新鲜雌花分别固定于配制好的卡诺固定液和FPA50中，每隔3～4小时更换一次固定液，换液2～3次即可，固定总时间为24小时或以上。固定后的材料保存于75%乙醇中。

1.2.2 脱水

水杨酸甲酯（即冬青油）作为透明剂：将材料转入30%乙醇中进行脱水1小时，然后依次转入50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇进行逐级脱水，每次脱水时间1小时。最后转入无水乙醇彻底脱水，中间换液2次，最后一次脱水12小时以上。

Herr 41/2和BB41/2作为透明剂：无需脱水或95%乙醇稍加脱水即可。

1.2.3 透明

冬青油透明：将完全脱水后的悬铃叶苎麻雌花转入无水乙醇与冬青油等体积混合液中进行过渡，中间换液2-3次，每次时间1小时。然后经纯冬青油透明，中间换液2-3次，最后一次透明24小时以上。

Herr 41/2和BB 41/2：将保存于70%乙醇中的材料直接转入或经95%乙醇稍加脱水后转入Herr 41/2或BB41/2中透明24小时或以上，期间更换透明液1～2次。

1.2.4 镜检

将透明好的材料连同透明剂转移到载玻片上（若材料较厚，为取得较好效果可用浅凹玻片），加盖玻片封存，在微分干涉差显微镜下观察胚珠发育情况，比较不同固定液和透明液组合的透明效果。

表1 不同固定液和透明液的组成配方Table 1 The composition and proportion ofthe different solutions

2 结果与分析

2.1 不同固定液的脱色效果

除FPA50脱色效果不理想外，其他3种改进的卡诺固定液在长时间处理样品后，脱色效果均较好。从表2中可以看出，卡诺1的脱色较迅速，在固定5小时后效果最好；固定24小时后卡诺1和卡诺2脱色效果近似，但优于卡诺3；待一周以后卡诺1、2、3均脱色较好。

表2 不同固定液的脱色效果Table 2 Decolorization effects ofdifferent fixingsolutions

2.2 不同固定液和透明液的处理效果

用不同的固定液和透明液组合处理悬铃叶苎麻雌花，并在显微镜下观察胚珠的脱色效果、立体感、反差大小、清晰度等项。镜检时任意确定一个视野，随机观察30个胚珠，记录内部结构可见的胚珠数，重复三次，并估算胚珠的透明率。试验结果见表3。

从表3可以看出：（1）卡诺1和卡诺2固定液总体的脱色效果优于卡诺3和FPA50，尤其卡诺1配合冬青油效果最好；（2）经F检验对各组透明率进行显著性分析，结果显示脱色效果对胚珠的透明率高低有显著影响，卡诺1和卡诺2固定的胚珠透明率显著高于卡诺3和FPA50（P＜0.05）；（3）固定液相同透明剂不同的各组相比来看，卡诺3固定时冬青油作为透明剂的透明率显著高于Herr 41/2和BB 41/2透明剂（P＜0.05），卡诺1和卡诺2固定时各组透明率没有显著差异（P＞0.05），FPA50固定时冬青油和Herr 41/2组透明率显著高于BB 41/2组（P＜0.05）。（4）在镜检观察效果方面，卡诺1固定组的立体感和反差整体优于其他各组，并且在固定液相同时，冬青油透明的立体感和反差一般优于Herr 41/2和BB41/2透明剂。

值得注意的是，大部分处理组合在显微观察胚胎发育时往往清晰度不高，尤其高倍镜下观察成像较模糊，只有卡诺1—冬青油组合和卡诺3—冬青油组合在高倍镜下成像较为清晰，其中又以前者成像效果好。鉴于以上结果的综合考虑，我们认为对于悬铃叶苎麻的雌花组织，采用卡诺1固定液配合冬青油透明较为合适，且从表3中的透明率可以看出，适当延长固定和透明的时间有助于提高此种方法的透明率。

2.3 不同处理方法的透明效果

根据前述试验结论，冬青油作为透明剂在各个固定液组合中效果好，且透明率较为稳定，尤其是高倍镜下观察时优势突出。本试验观察悬铃叶苎麻雌花发育各阶段的胚胎，对大孢子母细胞时期等相对较小的材料镜检时有较高要求，故选用冬青油作为透明剂。图1中各图为不同固定液配合冬青油透明时的微分干涉差显微镜镜检照片。A：卡诺1固定，冬青油透明；B：卡诺2固定，冬青油透明；C：卡诺3固定，冬青油透明；D：FPA50固定，冬青油透明。比较各图的透明效果可以看出，图A脱色效果好、清晰度高、立体感强，图B、C、D则依次存在细胞结构被破坏、内部结构不清晰、脱色效果差等不足。

图1 不同固定液固定胚珠的透明效果（透明剂均为冬青油）Figure 1 The clearingeffects ofdifferent fixingsolutions(transparent solution was methyl salicylate)

2.4 悬铃叶苎麻雌花胚胎发育的镜检结果

选用卡诺1固定液固定，配合冬青油透明的方法，对悬铃叶苎麻的雌花进行整体透明，观察胚胎的发育情况。镜检结果的照片见图2。

3 讨论

整体透明的核心步骤是固定和透明，固定使样品组织停止分裂并保持其活体状态，透明使之内部组织折射率不同便于显微镜观察，这在单子叶植物的胚胎和子房观察中已经取得了不错的效果[8-11]。近年来也有新方法不用固定，将胚珠悬浮在硅油中，通过电影摄影术对活胚囊进行观察，但这种方法往往对珠心和珠被的透明不足，所以未能普及。因此，本研究采用的卡诺1固定液配合冬青油观察悬铃叶苎麻雌花胚胎的整体透明技术仍然拥有显著技术优势[12]。卡诺1固定液的脱色效果好，能最大限度的保存胚珠内部结构不破坏，配合选用的3种透明剂均有较理想的透明效果和较高的透明率，其中以冬青油作为透明剂的效果最好。本研究表明，整体透明技术对于胚胎胞原期至成熟期的悬铃叶苎麻雌花都可以有效观察，并可以为快速判断胚胎的发育阶段提供一定的理论支持和试验基础。整体透明技术在对悬铃叶苎麻雌花的应用中也还存在一定的不足，如透明率偏低、拍摄的照片清晰度不高、对特定时期的胚胎观察不够精准等，因此还需要做更多的深入研究。

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