阿奇霉素对哮喘模型小鼠气道上皮细胞基质金属蛋白酶-9表达及气道重塑指标的影响研究Δ

郑美梅，王方剑，温武金，江 勇，段成城，潘小华（广州医学院附属深圳沙井医院呼吸内科，深圳市 518104）

气道重塑是支气管哮喘的重要病理特征之一[1]，是哮喘难以控制的一个重要原因。近年来，随着研究的深入，抑制和逆转气道重塑成为哮喘治疗的新方向。研究[2]发现，阿奇霉素可抑制炎症介质释放，减少黏液分泌，降低气道高反应，减轻哮喘临床症状，但能否抑制或逆转气道重塑尚不清楚。本课题通过复制哮喘模型小鼠，观察阿奇霉素对其气道上皮细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达及气道重塑指标的影响，为其在哮喘的临床治疗方面提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

YC-Y800超声雾化治疗仪（北京亚都科技股份有限公司）；TDL高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；石蜡切片机（美国Optical公司）；光学显微及照相系统（日本Olympus公司）；DC200图像采集及分析系统（德国Leica公司）。

1.2 试药

注射用乳糖酸阿奇霉素（以下简称阿奇霉素，哈药集团制药总厂，批号:B100501213，规格:每支0.25 g）；卵蛋白（美国Sigma公司分装，批号:A5253）；氢氧化铝（广州化学试剂厂，批号:20100302，分析纯）；地塞米松片（广东江门制药厂，批号:100502，规格:每片0.75 mg）；兔抗鼠MMP-9多克隆抗体及即用型免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 动物

BALB/c小鼠60只，SPF级，♂，8～10周龄，体重（20±3）g，由广州医学院动物实验中心提供，合格证号:2010A015。

2 方法

2.1 分组与给药

取小鼠60只，随机分为正常对照组（生理盐水）、模型组（生理盐水）、阳性对照组（地塞米松，0.18 mg·mL－1）和阿奇霉素低、中、高剂量组（0.2、0.4、0.8 mg·mL－1），每组10只。除正常对照组外其余各组均腹腔注射0.2 mL抗原液（卵蛋白10 μg、氢氧化铝20 mg配成100 mL），每隔2周注射1次，共3次；第3次注射1周后每天上午雾化卵蛋白30 min以激发哮喘，每日1次，连续15 d。模型组小鼠出现呼吸频率加快、点头呼吸、鼻翼煽动、抽搐等症状时示造模成功。每日雾化前1 h腹腔注射相应药物0.5 mL。阿奇霉素及地塞米松的用药剂量是将成人临床用药量按小鼠体表面积进行换算，得实验小鼠用药剂量为10 mg·kg－1·d－1；阿奇霉素低、中、高剂量组分别相当于临床拟定治疗剂量的20、10、5倍。

2.2 肺组织病理学变化

末次激发24 h后，处死小鼠取左肺组织，置于10%的中性甲醛溶液中，固定24 h后进行脱水，石蜡包埋、切片、苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察肺组织病理学变化。同时右肺组织切片后拟行免疫组化处理。

2.3 气道重塑指标的检测

左肺组织切片行HE染色后，400倍光镜下观察肺组织病理学改变。200倍光镜下选择20个完整的支气管横断面，图像分析软件测量基底膜周径（Pbm）、支气管总管壁面积（WAt）、气道内壁面积（WAi）、平滑肌面积（WAm），用Pbm将测量值标准化（以消除管径大小、气道状态以及切片方向不同等所造成的差别），分别代表总管壁厚度（WAt/Pbm）、内壁厚度（WAi/Pbm）、平滑肌厚度（WAm/Pbm），来衡量气道重塑程度。

2.4 气道上皮细胞MMP-9表达的检测

采用免疫组化染色法，参照二抗试剂盒说明书进行操作，取右肺组织石蜡切片，常规脱蜡至水，枸橼酸盐缓冲液微波加热修复，一抗稀释度为1∶100，DAB显色，苏木精复染，磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照，中性树胶封片观察。400倍光镜下，每张切片随机取5个支气管，用图像分析软件测量各组支气管上皮细胞胞浆中MMP-9阳性表达产物的平均光密度（OD）值，表示支气管上皮细胞MMP-9表达的相对含量。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 小鼠哮喘发作情况

末次激发后30 min内，除正常对照组外其余各组小鼠均出现呼吸频快、躁动、打喷嚏等症状；模型组症状重且持续时间长，严重者出现行动迟缓、食欲下降；阳性对照组和阿奇霉素各剂量组发作程度均较轻。

3.2 肺组织病理学变化

与正常对照组比较，模型组小鼠气道管腔狭窄，可见黏液栓堵塞，黏膜下层增宽，黏膜皱褶增多呈菊花状，气道壁及气道平滑肌层明显增厚，气道上皮细胞脱落，杯状细胞增多，黏膜下及管周可见有大量炎性细胞浸润；而阳性对照组和阿奇霉素各剂量组上述病变较模型组均减轻。各组小鼠肺组织病理学变化见图1。

图1 各组小鼠肺组织病理学变化（HE，×400）A.正常对照组；B.模型组；C.阿奇霉素低剂量组；D.阿奇霉素中剂量组；E.阿奇霉素高剂量组；F.阳性对照组Fig 1 Histopathological changes of mice lung in each group（HE，×400）A.normal control group；B.model group；C.azithromycin low-dose group；D.azithromycin medium-dose group；E.azithromycin high-dose group；F.positive control group

3.3 气道重塑指标比较

与模型组比较，阳性对照组和阿奇霉素各剂量组WAt/Pbm、WAi/Pbm、WAm/Pbm 3个指标均明显下降（P＜0.01），但仍显著高于正常对照组（P＜0.01）。各组小鼠气道重塑指标结果比较见表1。

表1 各组小鼠气道重塑指标结果比较（μm2·μm－1，，n＝10）Tab 1 Comparison of airway remodeling index of mice in each grou（pμm2·μm－1，，n＝10）

表1 各组小鼠气道重塑指标结果比较（μm2·μm－1，，n＝10）Tab 1 Comparison of airway remodeling index of mice in each grou（pμm2·μm－1，，n＝10）

与正常对照组比较:＊P＜0.01；与模型组比较:#P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.01；vs.model group:#P＜0.01

组别正常对照组模型组阿奇霉素低剂量组阿奇霉素中剂量组阿奇霉素高剂量组阳性对照组WAm/Pbm 3.94±0.437.97±0.17＊5.47±0.16＊#4.75±0.35＊#4.56±0.14＊#4.39±0.34＊#WAt/Pbm 7.15±0.8315.36±0.85＊11.80±0.30＊#10.15±0.95＊#9.87±0.12＊#8.23±0.62＊#WAi/Pbm 3.40±0.4310.64±1.03＊5.21±0.57＊#4.16±0.32＊#4.08±0.27＊#3.94±0.31＊#

3.4 MMP-9表达比较

正常对照组MMP-9在气道黏膜上皮细胞胞浆中有少量表达或不表达；模型组MMP-9在上皮细胞胞浆中呈强阳性表达，为棕色颗粒；阳性对照组和阿奇霉素各剂量组较模型组表达均减弱，颜色变浅。各组小鼠气道上皮细胞MMP-9免疫组化染色结果见图2，MMP-9表达比较见表2。

图2 各组小鼠气道上皮细胞MMP-9免疫组化染色结果（DAB，×400）A.正常对照组；B.模型组；C.阿奇霉素低剂量组；D.阿奇霉素中剂量组；E.阿奇霉素高剂量组；F.阳性对照组Tab 2 Immunohistochemical staining of airway epithelial cells MMP-9（DAB，×400）A.normal control group；B.model group；C.azithromycin low-dose group；D.azithromycin medium-dose group；E.azithromycin high-dose group；F.positive control group

表2 各组小鼠气道上皮细胞MMP-9表达比较（，n＝10）Fig 2 Comparison of MMP-9 expression of airway epithelial cells of mice in each grou（p，n＝10）

表2 各组小鼠气道上皮细胞MMP-9表达比较（，n＝10）Fig 2 Comparison of MMP-9 expression of airway epithelial cells of mice in each grou（p，n＝10）

与正常对照组比较:＊P＜0.05；与模型组比较:#P＜0.05vs.normal control group:＊P＜0.05；vs.model group:#P＜0.05

组别正常对照组模型组阿奇霉素低剂量组阿奇霉素中剂量组阿奇霉素高剂量组阳性对照组光密度值0.76±0.161.75±0.05＊1.42±0.83＊#1.34±0.03＊#1.28±0.15＊#0.98±0.17＊#例数101010101010

4 讨论

基质金属蛋白酶（MMPs）是调节细胞外基质代谢的主要限速酶，与哮喘气道重塑密切相关[3]。基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）是MMP-9的生理性特异抑制剂，正常时二者以1∶1的形式分泌，MMP-9/TIMP-1比值升高会导致组织损伤。研究[4，5]发现，哮喘患者的肺泡灌洗液、血清及痰中的MMP-9水平明显升高，黏膜下MMP-9 mRNA和蛋白表达也升高。哮喘急性发作期MMP-9占优势，不仅导致细胞外基质的降解和沉积紊乱，还可诱导以嗜酸粒细胞为主的白细胞的迁移[5]及平滑肌细胞的增殖与肥大[6]，进而引起气道重塑。因此，抑制MMP-9的过度表达成为治疗哮喘特别是难治性哮喘的重要研究方向。

本研究结果表明，阿奇霉素可能通过下调MMP-9的表达，延缓气道重塑的病理变化，从而减慢哮喘气道重塑的进程，但效果较地塞米松仍较弱。

[1]Holgate ST，Peters-Golden M，Jpanettieri RA，et al.Roles of cysteinyl leukotrienes in airway inflammation，smooth muscle function，and remodeling[J].J Allergy Clin Immunol，2003，111（Suppl 1）:S18.

[2]Piacentini GL，Peroni DG，Bodini A，et al.Azithromycin reduces bron-chial hyperresponsiveness and neutrophilic airway inflammation in asthmatic children:a preliminary report[J].Allergy Asthma Proc，2007，28（2）:194.

[3]王家珍，吴天清，周立远.Egb761对哮喘模型大鼠MMP-9及TIMP-1表达的影响和对气道重构的干预研究[J].中国药房，2008，19（24）:1845.

[4]Lee YC，Lee HB，Rhee YK，et al.The involvement of matrix metalloproteinase-9 in airway inflammation of patients with acute asthma[J].Clin Exp Allergy，2001，31（10）:1623.

[5]Atkinson JJ，Senior RM.Matrix metalloproteinase-9 in lung remodeling[J].Am J Respir Cell Mol Bio，2003，28（1）:12.

[6]Borger P，Tamm M，Black JL，et al.Asthma:is it due to an abnormal airway smoothmuscle cell？[J].Am J Respir Crit Care Med，2006，174（4）:367.