糖皮质激素局部封闭对兔肌肉组织的影响

苏连澍，张 政，王广舜，徐向英，赵宝泉

糖皮质激素主要由肾上腺皮质合成和分泌，具有参与机体的应激、免疫调节、抵御病原体侵入和抗炎等多方面的作用。糖皮质激素是临床广泛应用的药物，在骨科领域用于风湿性和类风湿性关节炎、腱鞘炎、滑囊炎等疾病的局部封闭治疗。由于操作简单、见效快，临床应用十分广泛。许多临床医生已经注意到，局部激素注射可以引起肌肉损伤及骨骼肌萎缩等副作用，但其相关的基础研究报道甚少。本文从局部激素注射对肌肉组织影响的实验研究入手，从显微和超微结构的水平研究激素对局部肌肉组织的影响，探讨骨骼肌萎缩的发生机制，为糖皮质激素的临床广泛应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 动物 清洁级健康成年新西兰大耳白兔24只，雌雄不限，4～6月龄（天津利居生物技术公司），体质量2.5～3.0 kg，单笼饲养，保持动物室环境干燥、通风、卫生，气温保持于15～25℃，给予常规实验室饮食。

1.2 试剂及仪器 曲安奈德注射液为昆明积大制药有限公司生产，批号070208，苏木素、伊红购自Sigma公司，Olympus BX-41型显微镜及数码采集系统为日本奥林帕斯公司产品，Image-ProPlus 5.1图像分析系统为美国Media Cybernetics公司产品，透射电镜观察由天津市第三中心医院电镜室协助完成。

1.3 动物模型建立 大耳白兔24只随机分为实验组与对照组。每只动物进行自身空白对照，以一侧臀肌做肌注侧，对侧臀肌为对照侧。精确称重后，实验组臀肌注射曲安奈德1mg/kg，定点注射，固定深度，每2周1次，共注射3次。对照组臀肌注射等量生理盐水。单笼饲养，常规实验室饮食。

1.4 取材 实验6周后常规静脉气栓法处死动物，取封闭部位肌肉组织及对照侧肌肉组织，大小分别为1cm×1cm×0.5cm及1cm×1cm×3cm大小，分别放入10%中性福尔马林固定液及pH7.4的4%戊二醛固定液中固定。

1.5 HE染色及观察 标本经10%中性福尔马林固定48 h后，常规梯度脱水、透明、石蜡包埋。将蜡块切成5～7 μm厚的组织薄片，进行HE染色。在Olympus光学显微镜下观察。用Image-ProPlus 5.1图像分析系统，测得单位面积内肌细胞最大直径及肌细胞数量。

1.6 电镜标本观察 标本在4℃下经4%戊二醛电镜固定液中浸泡4 h后，用二甲砷酸缓冲液充分洗涤，1%锇酸溶液后固定,梯度乙醇脱水,环氧树脂包埋修整后切片,切片厚度500～600 nm，铀铅染色，顺序经2550 X、6600 X和9900 X透射电镜观察。

1.7 统计学分析 应用SPSS 11.5统计学软件进行数据统计学处理。结果以均数±标准差（）记录，两样本之间进行方差齐性检验。结果满足方差齐性，采用两组独立样本资料的t检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色组织病理学改变 实验组肌注侧:骨骼肌细胞呈红色，其间可见血管和神经分布。纵切的骨骼肌细胞呈红色带状，可见多个细胞核，椭圆形，呈紫蓝色，位于肌膜下方。可见明暗相间的周期性横纹，大量红染的肌原纤维沿肌细胞长轴排列且横纹排列紊乱，部分明暗带有破坏。横切的骨骼肌纤维呈大小相近的红色块状断面，断面最大直径明显减小。单位面积下肌细胞数量增加。胞核圆形，染紫蓝色，位于细胞周边，胞质内含有丰富的红色肌原纤维。肌原纤维间含有大量线粒体、糖原以及少量脂滴。肌细胞内并可见空泡样变（图1、图2）。实验组对照侧:纵切的骨骼肌细胞呈红色带状可见多个细胞核，椭圆形，染紫蓝色，位于肌膜下方，可见明暗相间的周期性横纹，染红色的肌原纤维沿肌细胞长轴排列且横纹排列紊乱，部分明暗带有破坏。横切的骨骼肌纤维呈大小相近的红色块状断面，断面最大直径明显减小。单位面积下肌细胞数量增加。肌细胞内并可见空泡样变。与肌注侧无明显差别（图3、图4）。

图1 部分肌原纤维明暗带消失（HE×400）

图2 肌细胞内可见空泡样变性（HE×200）

图3 肌细胞内可见空泡样变性（HE×400）

图4 可见肌原纤维排列紊乱（HE×200）

对照组肌注侧:骨骼肌细胞红色，其间可见血管和神经分布。纵切的骨骼肌细胞呈红色带状可见多个细胞核，椭圆形，染紫蓝色，位于肌膜下方，可见明暗相间的周期性横纹，染红色的肌原纤维沿肌细胞长轴排列有序，无明暗带破坏。横切的骨骼肌纤维呈大小相近的红色块状断面，断面最大直径无减小。胞核圆形，染紫蓝色，位于细胞周边，胞质内含有丰富的红色肌原纤维。肌原纤维间含有大量线粒体、糖原以及少量脂滴。肌细胞间并未见空泡样变（图5）。对照组对照侧:与肌注侧无明显差别。

2.2 电镜观察肌肉组织病理学改变 实验组肌注侧:I型肌原纤维结构清晰，染色质均匀，形态正常，排列整齐有序，可见变形的线粒体及散在的糖原及脂质体，明带略增宽。低倍观可见II型肌纤维电子密度明显高于I型肌原纤维，且II型肌纤维自身电子密度不均，排列扭曲，肌节紊乱，结构模糊，肌膜溶解或融合，间质细胞变性，粗面内质网扩张，核间隙增宽（图6、图7）。实验组对照侧:I型肌原纤维结构清晰，染色质均匀，形态正常，排列整齐有序，可见变形的线粒体及散在的糖原及脂质体，明带略增宽。低倍观可见II型肌纤维电子密度明显高于I型肌原纤维，且II型肌纤维自身电子密度不均，排列扭曲，肌节紊乱，结构模糊，肌膜溶解或融合，间质细胞变性，粗面内质网扩张，核间隙增宽。与肌注侧无明显差别。

对照组肌注侧:I型肌原纤维排列有序，肌节各带清晰，内含丰富的糖原及少量线粒体。II型肌纤维平行排列，肌节清晰，糖原丰富，肌质管和肌膜局部清晰。I型与II型肌纤维电子密度均匀，相等。对照组对照侧:I型肌原纤维排列有序，肌节各带清晰，内含丰富的糖原及少量线粒体。II型肌纤维平行排列，肌节清晰，糖原丰富，肌质管和肌膜局部清晰。I型与II型肌纤维电子密度均匀、相等。与肌注侧无明显差别（图8）。

图5 可见肌原纤维明暗带（HE×400）

图6 左侧为严重损伤的Ⅱ型肌原纤维，肌节消失，线粒体肿胀，肌质管扩张，肌丝紊乱无序，右侧为Ⅰ型肌原纤维，未见明显异常

图7 Ⅱ型肌原纤维的电子密度明显高于相邻的Ⅰ型肌原纤维

图8 Ⅱ型肌原纤维排列整齐，肌节清晰糖原丰富，肌质管和肌膜均清晰

2.3 单位目镜下肌细胞数目 实验组臀部肌肉单位目镜下肌细胞数与对照组比较，差异有显著统计学意义，P＜0.01；对照组与实验组组内肌注侧与对照侧比较，差异无统计学意义，P＞0.05，见表1。

表1 实验组与对照组兔肌细胞数比较(n=12，)

表1 实验组与对照组兔肌细胞数比较(n=12，)

注:与对照组比较，*P＜0.01

组别对照组实验组肌注侧19.66±3.2832.57±6.20*对照侧20.50±4.8530.69±5.07*

2.4 最大肌细胞直径 实验组臀部肌肉最大肌细胞直径与对照组比较，差异有显著统计学意义，P＜0.01；对照组与实验组组内肌注侧与对照侧比较，差异无统计学意义，P＞0.05，见表2。

表2 实验组与对照组肌细胞最大直径测量结果比较 (n=12，μm，)

表2 实验组与对照组肌细胞最大直径测量结果比较 (n=12，μm，)

注:与对照组比较，*P＜0.01

组别对照组实验组肌注侧41.39±6.2631.28±6.13*对照侧40.92±5.6333.87±4.91*

3 讨论

糖皮质激素类药物是一类被广泛应用在关节炎、腱鞘炎、滑囊炎等局部封闭治疗的药物，其主要药理作用包括调节糖、脂肪、蛋白代谢、抗炎、免疫抑制、抗休克、抗毒素等。以往在用于一些慢性炎性和自身免疫性疾病的治疗过程中，人们发现长期大量应用糖皮质激素后患者骨骼肌明显萎缩，但其作用机制尚不完全清楚，可能与骨骼肌蛋白分解代谢增加和蛋白合成代谢减少有关。关于胰岛素样生长因子-1阻止糖皮质激素诱导的大鼠骨骼肌萎缩的研究结果发现[1]，受影响骨骼肌组织中胰岛素样生长因子-1减少，通过增加局部肌肉组织的胰岛素样生长因子-1，可防止糖皮质激素诱导的骨骼肌萎缩。糖皮质激素和肌肉组织分解代谢的关系研究显示[2]，泛素蛋白酶系统在皮质类固醇激素对骨骼肌的分解代谢中起重要作用。通过丙氨酰-谷氨酸盐阻止糖皮质激素诱导的肌肉萎缩研究中显示[3]，糖皮质激素主要通过影响氨基酸代谢中谷氨酸的合成来影响骨骼肌的合成。糖皮质激素诱导肌萎缩和基因表达有关，糖皮质激素受体拮抗剂RU-486可显著减轻骨骼肌萎缩。一方面，糖皮质激素作用于蛋白质合成的限速环节-核糖体起始复合物。激素-受体复合物与DNA上相应位点结合后降低了RNA的合成率，使总RNA量和核糖体RNA量减少，同时降低起始因子的活性，使蛋白质的翻译效率降低；另一方面，糖皮质激素作用于肌细胞中的泛素蛋白酶系统、碱性肌原纤维蛋白酶、溶酶体酶、钙蛋白酶系统促进蛋白质的降解。萎缩肌肉肌纤维变细，横截面积减小，无氧酵解型肌纤维较有氧氧化型肌纤维更容易受糖皮质激素的影响。泛素蛋白酶系统在皮质类固醇激素对骨骼肌的分解代谢中起重要作用，在蛋白质降解过程中，泛素首先与蛋白质底物共价结合，并作为蛋白降解的启动信号，后启动多步骤的降解过程，泛素氨基酸末端的甘氨酸与蛋白质赖氨酸残基的8-氨基共价结合后，由一个蛋白水解复合体对蛋白质进行迅速水解[4]。糖皮质类固醇是多种病理条件下介导骨骼肌蛋白质分解的主要因素，禁食或酸中毒大鼠在事先切除肾上腺的条件下骨骼肌蛋白分解并不增加，而一旦在饮水中加入皮质类固醇，骨骼肌蛋白质分解又增加。皮下注射地塞米松后大鼠伸趾长肌蛋白分解率显著升高，而且与地塞米松的剂量相关，伴有ATP依赖的泛素系统上调[5]，表明糖皮质激素通过其受体在基因水平增强泛素系统活性导致骨骼肌蛋白高分解代谢。糖皮质激素主要通过其与受体(GR)结合而发挥不同作用。然而，这种多效性作用也会产生不良反应，引起免疫抑制，高血压，抑制伤口修复，骨质疏松，肌肉萎缩以及代谢紊乱等。

骨骼肌纤维的分为I型纤维（红肌或慢缩肌），其较少而细，含肌红蛋白多，周围毛细血管丰富呈红色，故称红肌，反应速度慢，收缩力量较小，但持续时间长、不易疲劳，也称慢肌。II型纤维（白肌或快收缩肌）量多而粗，脂类物质、三磷酸腺苷和磷酸肌酸等含量比红肌多。I型纤维为有氧氧化型纤维，收缩速度慢，不易疲劳，对维持姿势起重要作用。II型纤维为无氧酵解型纤维，收缩速度快，力量大，但不能持久，易疲劳。通过氟美松对正常大鼠膈肌的影响研究中发现[6]，糖皮质激素对大鼠膈肌的最大张力无明显影响，但其耐力降低，易诱发疲劳。由此不难得出氟美松主要影响膈肌Ⅱ型肌纤维，对Ⅰ型肌纤维无明显影响，这与本研究的结果相同。在糖皮质激素对大鼠膈肌形态及功能作用的实验观察中，肌肉组织中的肌纤维比例没有影响，但是Ⅱ型纤维的横截面积明显变小，I型纤维改变较小。糖皮质激素诱导肌萎缩中不同肌纤维类型的改变研究结果显示[7]，萎缩肌肉肌纤维变细，横截面积减小，无氧酵解型肌纤维较有氧氧化型肌纤维更容易受糖皮质激素的影响。在对糖皮质激素诱导兔咬肌萎缩的实验研究中发现，曲安奈德有肯定的诱导肌萎缩的作用，主要为Ⅱ型肌纤维萎缩，对I型肌纤维无明显影响。这也与本研究得出的结论相同。但是我们观察到，糖皮质激素注射只对注射局部产生影响，对对照侧未产生明显影响，考虑这可能与糖皮质激素的用药量和用药时间有关。

糖皮质激素引起骨骼肌萎缩可能是通过多种途径和多种因素对细胞组织蛋白质和氨基酸代谢作用的结果。糖皮质激素局部封闭对全身及局部肌肉组织均产生影响，但差异没有统计学意义。提示局部封闭治疗可使肌肉细胞最大直径的减小，细胞数目减少，且影响II型肌原纤维的分布与排列，应可能是引起局部肌肉萎缩的主要原因之一。

[1]Schakman O,Gilson H,Coninck V de,et al.IGF-I gene transfer by electropo-ration prevents skeletal muscle atrophy in glucocorti⁃coid-treated rats[J].Endocr-inology,2005,146(4):1789.

[2]Hasselgren PO.Glucocorticoids and muscle catabolism [J].Curr-Opin Nutral Care,1999,2(3):201.

[3]Hickson RC，Wegrzyn LE,Osborne DF.Alanyl-glutamine prevents muscle atrophy and glutamine synthetase induction by glucocorti⁃coids[J].Am J Physiol,1996,271(5 Pt 2):R1165.

[4]李建平.肾上腺类固醇肌病[J].国外医学神经病学神经外科分册,2000,27(1):43.

[5]申传安,柴家科,姚咏明,等.糖皮质激素对大鼠骨骼肌蛋白分解代谢的影响及其机制团体探讨[J].中国危重病急救医学,2002,14(7):428.

[6]黄克武,许广润,吴丽娟,等.氟美松对正常大鼠膈肌的影响 [J].中华内科杂志,1997,36(6):80.

[7]柳大烈,刘玉生,杜本军,等.糖皮质激素诱导兔咬肌萎缩的实验[J].中国临床康复,2006,10(8):114.