靶向VP1和VP2双拷贝shRNA重组表达质粒抑制传染性法氏囊病病毒复制的研究

欧阳伟，王永山*，马金荣,，张海彬

(1.江苏省农业科学院兽医研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京 210014；2.南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095)

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种危害雏鸡的急性高度接触性传染病。IBDV感染不仅可导致患病鸡死亡，而且引起鸡的免疫抑制，造成疫苗免疫失败[1-7]。

IBDV属于双RNA病毒科双RNA病毒属，基因组包括大(A)小(B)两个片段。VP1是病毒的非结构蛋白，由B片段编码的一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)，与病毒RNA的复制和毒力有关[8-10]。VP2是病毒的主要结构蛋白之一，由A片段编码的多聚蛋白加工而成，位于病毒粒子的外表面，占总结构蛋白量的51%，属于病毒的主要保护性抗原，与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异以及细胞凋亡的诱导等有关[11]。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)能够使mRNA发生降解而导致基因表达沉默[12-13]。RNAi被认为是机体阻止外来病毒感染、保护细胞免受病毒入侵的一种细胞自我保护机制[14]。

本实验室前期的研究采用体外转录的方法分别制备了3个靶向VP1和3个靶向VP2的小干扰RNA(Short interfering RNA，siRNA)，在鸡胚成纤维细胞(CEF)中的功能分析表明，3个VP1-siRNA和3个VP2-siRNA均能明显抑制IBDV复制，其中VP1-siRNA2550和VP2-siRNA392的抑制效果最为显著[15]。在此基础上，本实验选择这两个高效siRNA，构建了由chU6启动的靶向IBDV VP1和VP2基因的双拷贝shRNAs重组表达质粒，鉴定其在CEF及鸡胚中对IBDV复制的抑制效果，为新型抗IBDV生物制剂与疫苗设计探索新的技术途径。

1 材料和方法

1.1 病毒株及主要试剂 IBDV B87 CEF适应病毒株和鸡胚适应病毒株为本实验室保存；9日龄～10日龄SPF鸡胚购自南京天邦生物科技有限公司；pSilencer 2.1-U6 neo购自Ambion公司；SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒、MiniBEST质粒纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自Invitrogen公司。

1.2 鸡U6启动子(chU6)的克隆 根据已发表的chU6基因序列(DQ531569)设计引物，chU6(F)：5'-CGGAATTCACGCGTCGACGCGGCCGCGACAAC ACAAGCATCGAG-3'； chU6(R)： 5'-CCCAAGCTT CCGCTCGAGCGGGATCCTAGTATATGTGCTGCCG AAGCGAGCACGGAC-3'。上游引物引入 EcoRⅠ、SalⅠ位点，下游引物引入HindⅢ、XhoⅠ、BamHⅠ位点，引物由Invitrogen公司合成。

取60日龄的来航鸡肝脏组织，按TIANDZ公司的柱式动物DNAout说明书提取基因组DNA，通过PCR扩增chU6启动子序列，克隆于pMD18-T载体中，EcoRⅠ和HindⅢ双酶切分析，获得含chU6启动子的重组质粒pMD-chU6并进行测序分析。

1.3 靶向VP1和VP2基因的shRNA分子设计根据本实验室前期研究结果[15]和shRNA设计原则[16]，选择IBDV VP1基因(DQ403249)的2550序列和VP2基因(AF508177)的392序列为靶标，设计编码shRNA的正义和反义链DNA序列，退火形成双链DNA，插入RNAi表达载体pSilencer 2.1-U6 neo，同步设立无shRNA的阴性对照。序列设计见表1和图1。

表1 编码shRNA的DNA序列Table 1 DNA sequence encoding shRNA

图1 shRNA的设计Fig.1 Design of the shRNA

1.4 双向chU6启动子双拷贝shRNA重组表达质粒的构建 将合成的编码VP1-shRNA2550和VP2-shRNA392的正向和反向互补单链DNA序列分别退火(图1)，得到VP1-shRNA2550和VP2-shRNA392双链DNA。将其分别插入pMD-chU6的BamHⅠ与XhoⅠ位点，分别获得pMD-chU6-VP1shRNA2550和pMD-chU6-VP2shRNA392重组质粒。用XhoⅠ单酶切pMD-chU6-VP2shRNA392，SalⅠ与XhoⅠ双酶切pMD-chU6-VP1shRNA2550，回收pMD-chU6-VP2shRNA392片段和chU6-VP1shRNA255片段，连接，转化，BamHⅠ单酶切分析，获得pMD-2chU6-VP1VP2shRNA。将pMD-2chU6-VP1VP2shRNA和表达载体pSilencer 2.1-U6 neo分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，回收2chU6-VP1VP2shRNA片段与pSilencer 2.1-U6 neo片段，连接，转化，EcoRⅠ和HindⅢ双酶切分析，获得双chU6启动子双shRNA重组表达质粒pSilencer2.1-2chU6-VP1VP2shRNA(中国发明专利申请号：201110127319.7)，简称为：pchU6-shRNA12(图2)。同步构建不含shRNA的对照质粒pchU6-CON。

图2 双chU6启动子双shRNA表达质粒的分子图谱Fig.2 Schematic diagram of the recombinant plasmid pchU6-shRNA12

1.5 pchU6-shRNA12在CEF中体外抑制IBDV试验 试验在6孔板上进行，按Lipofectamine2000说明书操作方法将 pchU6-shRNA12(4μg/孔)转染CEF，24 h后接种103TCID50的IBDV(B87株)，继续培养72 h，观察细胞病变(CPE)，收集CEF培养物，冻融3次，测定病毒滴度，用Reed-Muench法计算病毒的TCID50。实验同步设立pchU6-CON转染CEF、病毒感染和正常CEF对照组。

1.6 pchU6-shRNA12在鸡胚中抑制IBDV试验将 pchU6-shRNA12(8 μg/ 胚 )与 IBDV(103TCID50/胚)混合，一起接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔中，同步设立pchU6-CON以及单独接种IBDV对照组。观察鸡胚生长和发育状况，96 h后，收集鸡胚组织和尿囊液，接种10日龄SPF鸡胚，测定病毒滴度，用Reed-Muench法计算病毒的ELD50。

根据IBDV VP1基因、VP2基因和鸡β-actin基因(作为内参对照)序列设计引物(表2)，引物由上海Invitrogen公司合成。

表2 荧光定量RT-PCR引物Table 2 Primers for real time quantitative RT-PCR

用TRIzol试剂方法提取鸡胚组织和尿囊液混合物的总RNA，按照SYBR PrimeScript RT-PCR Kit使用说明进行反转录合成cDNA，将cDNA用EASY Dilution按10倍梯度稀释，再将各稀释度的cDNA作为模板进行SYBR GreenⅠreal-time PCR扩增，以β-actin基因作为内参照。实时荧光定量PCR仪为LightCycler 480Ⅱ(Roche公司)，扩增结果采用Roche LightCycler 480 SW1.5.0软件做相对定量分析，计算抑制效率。

2 结 果

2.1 chU6启动子的克隆 以鸡的基因组DNA为模板，PCR扩增获得约为600 bp的chU6启动子，将其克隆于pMD18-T中，经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切分析，可见2条长度分别约600 bp和2700 bp的DNA片段，与chU6基因片段(593 bp)和pMD18-T载体大小理论值相符合(图3)。

图3 pMD-chU6的酶切图谱Fig.3 Identification of pMD-chU6

2.2 chU6的生物信息学分析 将测定的chU6启动子序列在GenBank中进行BLAST分析，chU6启动子173-566位核苷酸序列(GenBank中登录号：JN127375)与已发表的鸡U6(DQ531569)启动子序列同源性为96%，而与人源的U6启动子(人染色体15∶NCBI35∶15∶65919386∶65919660∶-1)同源性为 6.2%，与鼠源的 U6启动子(鼠染色体 9∶NCBIM33∶9∶63370029∶63370291∶1)同源性为 9.9%。用 TFSEARCH分子生物学软件对克隆的chU6启动子转录因子结合位点分析，有4个潜在的Oct-1结合位点和其它转录因子结合位点，含有RNA聚合酶Ⅲ的3个上游元件：OCT(ATTTGCAT)、PSE(GTCACTGTGTTCT AAAAGAACTTG)、TATA(TTAAATA)。

2.3 双向chU6启动子双拷贝shRNA重组表达质粒的构建 将2chU6-VP1VP2shRNA基因片段和pSilencer 2.1-U6 neo载体片段连接，获得重组表达质粒pchU6-shRNA12，经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切分析，可见2条长度分别约1300 bp和4200 bp的DNA片段，与pSilencer 2.1-U6 neo和2chU6-VP1VP2shRNA基因片段(1324 bp)的理论值相符合(图4)。

2.4 pchU6-shRNA12在CEF中的抗病毒活性检测将 pchU6-shRNA12转染的CEF，接种 IBDV，72 h后，未见CPE，细胞形态呈正常的梭状。而pchU6-CON转染组和IBDV感染CEF两个对照组则呈现典型的CPE(图5)。病毒滴度测定结果表明，pchU6-shRNA12转染组的病毒滴度小于101TCID50/0.1 mL，而pchU6-CON转染组和IBDV感染组两个对照组的病毒滴度均达到108.75TCID50/0.1 mL(图6)。

2.5 pchU6-shRNA12在鸡胚中的抗病毒活性检测将pchU6-shRNA12与IBDV混合接种的SPF鸡胚，96 h后，鸡胚继续存活，检查胚体发育正常；而同步接种pchU6-CON以及单独接种IBDV的两个对照组的鸡胚则全部死亡，胚体发育阻滞、出血(图7)。采用10日龄SPF鸡胚测定鸡胚组织和尿囊液混合物的ELD50，pchU6-shRNA12组病毒滴度小于101ELD50/0.1 mL，而pchU6-CON组和IBDV感染组两个对照组的病毒滴度均达到107.00ELD50/0.1 mL(图8)。用实时荧光定量RT-PCR对VP1基因和VP2基因的拷贝数进行定量检测，pchU6-shRNA12转染组VP1基因比IBDV对照组降低了92%，VP2基因比IBDV对照组降低了95%(图9)。

3 讨 论

常用的shRNA表达载体中RNA聚合酶Ⅲ启动子(polⅢ)主要为人源或鼠源的U6启动子或人H1启动子，它们在禽源细胞中的转录活性说法不一。Katahira等的研究结果显示，小鼠U6启动子能够驱动shRNA在鸡胚中表达[17]。Dai等也证明，人H1和U6启动子能驱动GFP基因特异性shRNA在鸡胚中表达[18]。而Das等则获得与上述相反的结果[19]。鉴于此，本研究为了构建靶向IBDV的shRNA高效表达质粒，将shRNA表达载体pSicencer2.1-U6 neo中的人源U6启动子替换成chU6启动子。采用PCR方法从鸡的基因组DNA中扩增克隆的chU6启动子，与鸡的同源性较高，而与人、鼠的同源性较低，该chU6启动子转录因子结合部位含有RNA polⅢ的3个上游元件，通常认为，在RNA polⅢ的上游启动子中，只要靠近起点存在TATA元件，就能起始转录，PSE和OCT元件的存在可提高转录效率[20]。

本研究在前期研究基础上，根据RNAi效率高的VP1-siRNA2550和VP2-siRNA392两个序列，设计VP1-shRNA2550与VP2-shRNA392，选用chU6启动子，构建一个同时靶向IBDV VP1和VP2基因的双向chU6启动子双拷贝shRNA表达质粒pchU6-shRNA12，其中 VP1-shRNA2550和 VP2-shRNA392分别由独立的chU6驱动表达。该pchU6-shRNA12有3个特点：用chU6启动子替代人源U6启动子，以提高外源shRNA在鸡细胞中的转录效率；VP1-shRNA2550和VP2-shRNA392双shRNA可以同时抑制IBDV的两个功能基因VP1和VP2转录表达，双倍提高RNAi效果；双启动子独立驱动两个shRNA高效转录，不受转录位置先后的影响。

为验证pchU6-shRNA12在活体外抑制IBDV复制的功能，用pchU6-shRNA12在CEF进行了IBDV复制的抑制实验，干扰组未出现CPE，细胞培养物中的病毒滴度小于101TCID50/0.1 mL；而对照组均出现明显的CPE，病毒滴度均达到108.75TCID50/0.1 mL。Gao等根据IBDV VP1基因的2571序列构建了shRNA表达载体，在Vero细胞上进行了对IBDV复制的抑制实验，抑制率为87.4%[21]。与之相比，pchU6-shRNA12具有更高的抑制效果，分析原因可能是由于pchU6-shRNA12转录产物能同时靶向降解VP1和VP2基因，因此，对IBDV的干扰效率更高。本实验用转染试剂Lipofectamine2000递呈表达质粒，其干扰效果与不用转染试剂相当(实验数据未提供)。

为进一步验证pchU6-shRNA12在活体内抑制IBDV的复制能力，用鸡胚进行了鸡胚感染抑制试验。pchU6-shRNA12转染组鸡胚发育正常，鸡胚组织和尿囊液混合物病毒滴度显著低于两个对照组，表明pchU6-shRNA12在鸡胚内也能抑制IBDV的复制；用荧光定量RT-PCR分别检测VP1和VP2的表达量，pchU6-shRNA12转染组比单纯接种IBDV对照组分别降低了92%和95%，进一步表明IBDV复制的抑制是由于VP1和VP2基因被特异性降解所致。

本研究结果表明：chU6启动子在pchU6-shRNA12中能高效驱动双拷贝shRNA的转录，转录的siRNA在体外(CEF)以及体内(鸡胚)均能抑制IBDV的复制，为IBDV新型治疗预防生物制品的研发探索出了一条新的技术途径。目前正在进行动物实验。

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